第二章基因诊断 的发展历程 基因诊断的发展历程 基因诊断技术的发展,经历了间接 基因诊断、直接基因诊断、动态基因诊 断三个主要阶段 1间接基因诊断 间接基因诊断是利用遗传标志,推 测某一疾病基因的存在与否,从而辅助 疾病诊断。遗传标志经历了三代发展, 简述如下: 第一代多态性标志:限制性片段长度多 态性(RFLP) restriction fragment length polymorphisms 该技术由 Grodzicker等于1974年创 特定生物类型的基因组DNA经某 种限制性内切酶完全酶解后,会产生分 子量不同的同源等位片段,或称限制性 等位片段。RFLP标记技术的基本原理 就是通过电泳的方法分离和检测这些 片段。凡是可以引起酶解位点变异的突 变,如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA的重新组织(如插入和缺失 造成酶切位点间的长度发生变化)等均 可导致限制性等位片段的变化,从而产 生RFLP
第二章 基因诊断 的发展历程 基因诊断的发展历程 基因诊断技术的发展，经历了间接 基因诊断、直接基因诊断、动态基因诊 断三个主要阶段。 1 间接基因诊断 间接基因诊断是利用遗传标志，推 测某一疾病基因的存在与否，从而辅助 疾病诊断。遗传标志经历了三代发展， 简述如下： 第一代多态性标志：限制性片段长度多 态性（RFLP）restriction fragment length polymorphisms 该技术由Grodzicker等于1974年创 立。 特定生物类型的基因组DNA经某一 种限制性内切酶完全酶解后，会产生分 子量不同的同源等位片段，或称限制性 等位片段。RFLP标记技术的基本原理 就是通过电泳的方法分离和检测这些 片段。凡是可以引起酶解位点变异的突 变，如点突变（新产生和去除酶切位点） 和一段DNA的重新组织（如插入和缺失 造成酶切位点间的长度发生变化）等均 可导致限制性等位片段的变化，从而产 生RFLP
第二代多态性标志 1985年 Jeffreys发现重复序列及其多 态性 VNTR(variable number of tander repeat) 可变数串联重复序列( Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)it 常由二个核甘酸组成的单元如"胞嘧啶 +腺嘌啉"(CA)经过若干次重复组成,由 于重复的次数(即n值)是可变的,因而构 成一种多态类型在非严格定义的情况 下,也称为微卫星重复多态然而VNTR 是从多态自身的结构特点来命名的,而 微卫星重复多态是从此类DNA在梯度 离心分离时所表现的特性提出来 的WNTR是近年提出的概念因其在基 因组中分布极为丰富故应用日趋广泛 就某一WNTR而言通常重复单元可以表 现出几次到几十次不同的重复,并由此 决定不同的长度类型,因而其蕴含的多 态信息量(PIC较大 STR(short tandem repeat) 人类基因组DNA有3×109bp,其 中10%是串联重复序列,称为卫星 DNA。按重复单位的长短,又可分为大 卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中 重复单位仅由26 bases组成的叫微卫 星( microsatellite analysis),又称它 为短串联重复序列( Short Tandem Repeat.STR),STR是存在于人类基 因组DNA中的一类具有长度多态性的 DNA序列,不同数目的核心序列呈串 联重复排列,而呈现出长度多态性,通 常多态性片段长度在100300bp。一般 认为,人类基因组DNA中平均每6 10kb就有一个STR位点,其多态性成 为法医物证检验个人识别和亲子鉴 的丰富来源。不同人体基因组卫星DNA 重复单位的数目是可变的,因此,形 成了极其复杂的等位基因片段长度多 态性
第二代多态性标志： 1985 年Jeffreys 发现重复序列及其多 态性 VNTR(variable number of tandem repeat) 可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat,VNTR)通 常由二个核甘酸组成的单元如"胞嘧啶 +腺嘌啉"(CA)经过若干次重复组成,由 于重复的次数(即n值)是可变的,因而构 成一种多态类型.在非严格定义的情况 下,也称为微卫星重复多态,然而VNTR 是从多态自身的结构特点来命名的,而 微卫星重复多态是从此类DNA在梯度 离心分离时所表现的特性提出来 的.VNTR是近年提出的概念,因其在基 因组中分布极为丰富,故应用日趋广泛. 就某一VNTR而言,通常重复单元可以表 现出几次到几十次不同的重复,并由此 决定不同的长度类型,因而其蕴含的多 态信息量(PIC)较大. STR(short tandem repeat) 人类基因组 DNA 有 3×109bp，其 中 10%是串联重复序列，称为卫星 DNA。按重复单位的长短，又可分为大 卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中 重复单位仅由 2-6bases 组成的叫微卫 星（microsatellite analysis），又称它 为短串联重复序列(Short Tandem Repeat. STR)，STR 是存在于人类基 因组 DNA 中的一类具有长度多态性的 DNA 序列，不同数目的核心序列呈串 联重复排列，而呈现出长度多态性，通 常多态性片段长度在 100-300bp。一般 认为，人类基因组 DNA 中平均每 6～ 10kb 就有一个 STR 位点，其多态性成 为法医物证检验个人识别和亲子鉴定 的丰富来源。不同人体基因组卫星 DNA 重复单位的数目是可变的，因此， 形 成了极其复杂的等位基因片段长度多 态性
第三代多态性标志:单核苷酸多态性 SNP(single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在 基因组水平上由单个核苷酸的变异所 引起的DNA序列多态性 1.1第一代多态性标志 基本步骤: DNA提取→用DNA限制性内切酶 消化 →凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和 位置转移到易操作的滤膜上 →用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜上的 DNA杂交(称 Southern杂交) 放射性自显影或酶学检测显 示出不同材料对该探针的限制性 酶切片段多态性。 例: ECoR I酶切示意图 AG----GAATTC---GAATTC---GAATT C---CG 3 C----CTTAAG---CTTAAG----CTTAA
第三代多态性标志：单核苷酸多态性 SNP(single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在 基因组水平上由单个核苷酸的变异所 引起的DNA序列多态性。 1.1 第一代多态性标志 基本步骤： DNA提取→用DNA限制性内切酶 消化 →凝胶电泳分离限制性片段 →将这些片段按原来的顺序和 位置转移到易操作的滤膜上 →用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜上的 DNA杂交（称 Southern杂交） →放射性自显影或酶学检测显 示出不同材料对该探针的限制性 酶切片段多态性。 例：EcoRⅠ酶切示意图 5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATT C---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAA
--GC5 AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5 AG----GAATTC---GAATCC----GAATT C---CG 3 TC----CTTAAG---CTTAGG---CTTAA G---GC51 AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA CTTAGG----CTTAA G---CG RFLP标记的主要特点: (1)遍布于整个基因组,数量几乎是 无限的 (2)无表型效应,不受发育阶段及器 官特异性限制 (3)共显性,可区分纯合子和杂合子; (4)结果稳定、可靠; (5)DNA需要量大,检测技术繁杂 难以用于大规模的育种实践中。 限制性片段长度多态(RFLP)分析 在人群中,不同个体之间,其DNA碱 基序列存在着DNA多态性。据估计 大约每100~200个碱基中就有一个发 生中性替代而出现多态性。尽管这种多 态性并不引起疾病,但却可影响到限制 酶的切点改变。由于RFLP呈孟德尔式 遗传,因此可用为染色体上疾病基因座 位的遗传标记,通过RFLP的连锁分析, 对疾病进行间接诊断,来推测一个家庭 成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在
G---GC 5’ AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC 5’ AG----GAATTC---GAATCC----GAATT C---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAGG----CTTAA G---GC 5’ AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAGG----CTTAA G---CG RFLP标记的主要特点： （1）遍布于整个基因组，数量几乎是 无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段及器 官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂， 难以用于大规模的育种实践中。 限制性片段长度多态(RFLP)分析 在人群中，不同个体之间，其 DNA 碱 基序列存在着 DNA 多态性。据估计， 大约每 100～200 个碱基中就有一个发 生中性替代而出现多态性。尽管这种多 态性并不引起疾病，但却可影响到限制 酶的切点改变。由于 RFLP 呈孟德尔式 遗传，因此可用为染色体上疾病基因座 位的遗传标记，通过 RFLP 的连锁分析， 对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭 成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在
20世纪80年代中期已应用这一技术成 功地进行了B地中海贫血病、苯丙酮 尿症等遗传病的基因诊断 RFLP连锁分析是一种十分有用的 遗传病诊断技术,适用于诊断任何一种 单基因遗传病。由于DNA多态性基因 座普遍存在于人体基因组中,即使突变 的遗传病基因序列或基因产物还不清 楚,但只要找到和突变基因连锁的 RFLP基因座,就可以利用RFLP连锁 分析进行遗传病的基因诊断和产前诊 断。有人提出如果建立起一套以20cM 间隔的平均分布于整个基因组的RFLP 基因座,并选用合适的探针,就有可能 对所有的遗传病进行基因诊断。 第一代多态性标志的应用 (1)1978年 YWKan首次利用 RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基 因诊断 Hpaβ珠蛋 白基因片段(kb) Hb基因型 总计 130kb片段的频率 7.67.67.6/7.0 7.013.07.6/13.013.013.0 白人AS51 9 0.31
20 世纪 80 年代中期已应用这一技术成 功地进行了 β 地中海贫血病、苯丙酮 尿症等遗传病的基因诊断。 RFLP 连锁分析是一种十分有用的 遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种 单基因遗传病。由于 DNA 多态性基因 座普遍存在于人体基因组中，即使突变 的遗传病基因序列或基因产物还不清 楚，但只要找到和突变基因连锁的 RFLP 基因座，就可以利用 RFLP 连锁 分析进行遗传病的基因诊断和产前诊 断。有人提出如果建立起一套以 20cM 间隔的平均分布于整个基因组的 RFLP 基因座，并选用合适的探针，就有可能 对所有的遗传病进行基因诊断。 第一代多态性标志的应用 （1） 1978年YW Kan 首次利用 RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基 因诊断 ——————————————— ——————————————— —————————————— Hpa Iβ珠蛋 白基因片段（kb） Hb基因型 ——————————————— ——————— 总 计 13.0kb片段的频率 7.6/7.6 7.6/7.0 7.0/13.0 7.6/13.0 13.0/13.0 ——————————————— ——————————————— —————————————— 白人AS 5 1 1 9 0 16 0.31
4 11 0 0 黑人AA86 0.03 亚洲AA15 0 0 镰形红细胞贫血症基因诊断示意图: MstⅡ部位 1. 15kb ISv rvs-Ⅱ 如次 正常 性状贫血 135kb 1. 15kb 镰形红细胞贫血症的基因诊断 限制酶MstⅡ所识别的DNA碱基 序列是 CCTGAGG,而这是正常β珠蛋 白基因(βA)第6个密码子及其前后的碱 基序列。经MstⅡ切开,形成1.15kb和 0.2kb两个片段。但当正常β珠蛋白基 因突变为镰形细胞贫血基因(βS)时,第 6个密码子GAG突变为GTG,于是 CCTGAGG变成 CCTGTGG,而不能被 stⅡ所识别,以致酶切时产生1.35kb 的DNA片段。据此,可以对镰形细胞 贫血病进行基因诊断
SS 0 0 0 4 11 15 0.87 AA 12 0 0 0 0 12 0 黑人AA 8 6 0 1 0 15 0.03 亚洲AA 15 0 0 0 0 15 0 ——————————————— ——————————————— —————————————— 镰形红细胞贫血症基因诊断示意图： 限制酶 MstⅡ所识别的 DNA 碱基 序列是 CCTGAGG，而这是正常 β 珠蛋 白基因(βA)第 6 个密码子及其前后的碱 基序列。经 MstⅡ切开，形成 1.15kb 和 0.2kb 两个片段。但当正常 β 珠蛋白基 因突变为镰形细胞贫血基因(βS)时，第 6 个密码子 GAG 突变为 GTG，于是 CCTGAGG 变成 CCTGTGG，而不能被 MstⅡ所识别，以致酶切时产生 1.35kb 的 DNA 片段。据此，可以对镰形细胞 贫血病进行基因诊断
连锁的R Bcl/探针B 145S/探针A 缺失Ⅷ因子基因 5-m■ -IITT TITIH-3 正常Ⅷ因子基因 血友病A的诊断为例 血友病A是一种X连锁隐性遗传病。用 VI因子基因的cDNA片段作为探针对待 检者DNA酶切片段进行杂交,就可检出 VI因子基因部分缺失的男性患者和女 性携带者 家系Ⅲ-1患有严重的血友病A,经 V因子治疗后产生V因子抑制物。用 两种不同的内切酶和探针组合对家系 成员作RFLP分析。应用BclI/探针B (VⅢ因子基因)Ⅶ因子基因部分缺失 所致血友病A的基因诊断 探针A是V因子基因1.7 kb Kpn I DNA片段,包括1~12外显子。探针B
（ 2 ） X 连 锁 的 R F L P 以 血 友 病 A 的 诊 断 为 例 ， 血友病 A 是一种 X 连锁隐性遗传病。用 VⅢ因子基因的 cDNA 片段作为探针对待 检者 DNA 酶切片段进行杂交，就可检出 VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女 性携带者。 家系Ⅲ-1 患有严重的血友病 A，经 VⅢ因子治疗后产生 VⅢ因子抑制物。用 两种不同的内切酶和探针组合对家系 成员作 RFLP 分析。应用 Bcl I/探针 B （VⅢ因子基因）VⅢ因子基因部分缺失 所致血友病 A 的基因诊断 探针 A 是 VⅢ因子基因 1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括 1～12 外显子。探针 B
是V因子基因4.7 kb EcoR I cdna片 段,包括14~25和部分26外显子。A、 B、C、D代表X染色体。 患者无BCl/探针1.2和4.4bk,但 有SstI/探针A14.5kb、4.7 kb Eco i CDNA片段,包括14~25和部分26外显 子,患者不见1.2kb和4.4kb。应用Sst I/探针A(因子基因1.7 kb Kpn I CDNA 片段,包括1~12外显子),患者和他 的母亲(必然杂合子)出现异常的 14.5kb。这一实验结果表明,VⅢ因子 基因3’端部分缺失后,其5’端残留 部分可由SstI/探针A检出。杂合子兼 有BclI/探针B检出的1.2kb和4.4kb 与SstI/探针检出的14.5kb 1.2第二代多态性标志 串联重复多 态性的类型 类别 重 复单位的大小 要染色体区域 卫星DNA(100kb) 1(AT) 25~48 粒等异染色质区 2和3 5 大部 分染色体中 alphoid DNA 171 Sau3A family 1/9/13/14/1521/22/Y的 着丝粒等异染色质区
是 VⅢ因子基因 4.7kb EcoR I cDNA 片 段，包括 14～25 和部分 26 外显子。A、 B、C、D 代表 X 染色体。 患者无 Bcl/探针 1.2 和 4.4bk,但 有 Sst I/探针 A14.5kb、4.7kb EcoR I cDNA 片段，包括 14～25 和部分 26 外显 子，患者不见 1.2kb 和 4.4kb。应用 Sst I/探针 A（因子基因 1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括 1～12 外显子），患者和他 的母亲（必然杂合子）出现异常的 14.5kb。这一实验结果表明，VⅢ因子 基因 3’端部分缺失后，其 5’端残留 部分可由 Sst I/探针 A 检出。杂合子兼 有 Bcl I/探针 B 检出的 1.2kb 和 4.4kb 与 Sst I/探针检出的 14.5kb。 1.2 第二代多态性标志 串联重复多 态性的类型 ———————————————— —————————————— ——————— 类 别 重 复 单 位 的 大 小 主 要 染 色 体 区 域 ———————————————— —————————————— ——————— 卫星DNA（100kb） 1（AT） 25～48 着丝 粒等异染色质区 2 和3 5 大部 分染色体中 alphoid DNA 171 Sau3A family 68 1/9/13/14/15/21/22/Y的 着丝粒等异染色质区
小卫星DNA(01~20kb) 6 超变家族 9~24 端粒附近 微卫星DNA(小于150bp 2~6 所 有染色体中 Variable number of tandem repeats allele 1 allele 2 allele 3 串联重复多态性的遗传串联重复 短 allele 4 列( short tandem repeat,sTR)又称微卫 星DNA,是基因组中广泛存在的一种 重复结构,它的核心序列一般有2~6 碱基构成,核心序列重复次数构成了遗 传多态性。它散布于整个基因组中,平
小卫星DNA（0.1~20kb） 端粒家族 6 端粒 超变家族 9～24 端粒附近 微卫星DNA （小于150bp） 2~6 所 有染色体中 ———————————————— —————————————— ———————— （ 1 ） 串 联 重 复 多 态 性 的 遗 传 短 串 联 重 复 序 列（short tandem repeat, STR）又称微卫 星 DNA,是基因组中广泛存在的一种 重复结构 ,它的核心序列一般有 2～6 碱基构成 ,核心序列重复次数构成了遗 传多态性。它散布于整个基因组中 ,平
均每15kb就存在一个STR基因座,具 有分布广泛,易于检测,信息量大,由 高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传 等优点。它不仅可以用作绘制基因组遗 传图谱和遗传连锁分析的标尺,而且可 用于法医学中的个体识别和亲权鉴定 右图:用串联重复多态性方法可检测高 变常染色体DNA多态性的共显性遗传 等位基因1-4是彼此相关的短小DNA序 列。通过限制酶消化能区分多态性片段 的大小。 1.3第三代多态性标志 SNP是指由单个核苷酸替代、插入 或缺失而形成的分子多态,有时也包括 由多个核苷酸插入或缺失造成的点突 变,它是人类基因组中数量最多的一种 多态形式。人类基因组中总共有300万 个SNP,平均每1000个碱基中就有 个。SNP是一种双等位基因( diallele 形式,是基因组中某位点要么突变,要 么正常的多态。单个SNP所携带的信息 量比不上多等位基因形式的微卫星多 态,但在人类基因组中,SNP的数量远 远多于微卫星多态。大量SNPs总体所 具有的信息量十分可观,大约700~900 个SNP提供的信息量相当于300~400 个微卫星提供的信息量
均每 15kb 就存在一个 STR 基因座，具 有分布广泛 ,易于检测 ,信息量大 ,由 高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传 等优点。它不仅可以用作绘制基因组遗 传图谱和遗传连锁分析的标尺 ,而且可 用于法医学中的个体识别和亲权鉴定。 右图：用串联重复多态性方法可检测高 变常染色体DNA多态性的共显性遗传。 等位基因1-4是彼此相关的短小DNA序 列。通过限制酶消化能区分多态性片段 的大小。 1.3 第三代多态性标志 SNP 是指由单个核苷酸替代、插入 或缺失而形成的分子多态，有时也包括 由多个核苷酸插入或缺失造成的点突 变，它是人类基因组中数量最多的一种 多态形式。人类基因组中总共有 300 万 个 SNP，平均每 1000 个碱基中就有一 个。SNP 是一种双等位基因（biallele） 形式，是基因组中某位点要么突变，要 么正常的多态。单个 SNP 所携带的信息 量比不上多等位基因形式的微卫星多 态，但在人类基因组中，SNP 的数量远 远多于微卫星多态。大量 SNPs 总体所 具有的信息量十分可观，大约 700～900 个 SNP 提供的信息量相当于 300~400 个微卫星提供的信息量