第一篇组成人体的细胞 第二章基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域,抗体已被成功地应用于捕获靶分子(抗原)、亲和层 析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等诸多方向。这些技术所利用的其实就 是抗体与抗原发生特异性结合的特性,所有这些基于抗体的研究技术主要可被分 为四种类型:①利用抗体“示踪”靶分子;②利用抗体去捕获靶分子;③利用抗 体进行蛋白功能学研究;④通过和芯片技术的结合用于蛋白表达谱研究。 第一节抗体的标记 在绝大多数情况下,当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目 的之不同,所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 抗体的标记的直接法与间接法 (一)直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合,然后再与靶分子(抗原) 结合,通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子(抗原)进行定性、定位、定量 测量的方法。 (二)间接法 间接法与直接法不同,抗体既不需纯化也不需标记,而是在抗体与相应靶分 子(抗原)结合后,洗去未结合抗体,然后通过利用己标记好的第二抗体(二抗) 与一抗的结合来间接标记出靶分子(抗原)的存在情况。此方法带有比直接法更 多的标记物,因此较直接法灵敏。 标记物的选择 无论是直接法还是间接法,标记物的选择至关重要。表1-2-1所列出的就是 一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表1-2-1标记物的选择
第一篇 组成人体的细胞 第二章 基于抗体的细胞化学显示 在生命科学研究领域，抗体已被成功地应用于捕获靶分子（抗原）、亲和层 析纯化蛋白、组织细胞中靶分子定位研究等诸多方向。这些技术所利用的其实就 是抗体与抗原发生特异性结合的特性，所有这些基于抗体的研究技术主要可被分 为四种类型：①利用抗体“示踪”靶分子；②利用抗体去捕获靶分子；③利用抗 体进行蛋白功能学研究；④通过和芯片技术的结合用于蛋白表达谱研究。 第一节 抗体的标记 在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。依据实验目 的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。 一、抗体的标记的直接法与间接法 （一）直接法 直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原） 结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量 测量的方法。 （二）间接法 间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分 子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗） 与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。此方法带有比直接法更 多的标记物，因此较直接法灵敏。 二、标记物的选择 无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。表 1-2-1 所列出的就是 一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。 表 1-2-1 标记物的选择
标记物 检测方法 优点 应用 生物素 与各种标记物偶保存时间长,灵步骤过多,存在免疫组化 联的亲和素与链敏度高,检测手内源性生物素干印迹 霉亲和素 段多样 扰,有些底物对 人体有害 荧光色素 荧光显微镜或荧保存时间长,分自发荧光,易淬免疫组化 光计 辨率高 灭 底物显色 保存时间长,灵步骤过多,存在免疫组化、免疫 敏度高,肉眼直内源性酶的干印迹 接可见,检测手扰,分辨率低, 段多样 有些底物对人体 有害 1251或131I Y计数仪、放射易于直接标记,半衰期短,对人免疫印迹、定性 自显影 灵敏度高 体有害 定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β不损伤抗体、操半衰期短,敏感免疫印迹、定性 计数仪 作简便 性低,需杂交瘤定量免疫分析 细胞 胶体金 显微镜、电镜、特异性强、灵敏对试剂、玻璃器免疫组化、流式 肉眼 度高、应用范围皿内的要求极细胞术、定性定 广、可用于双重高,标记物浓度量免疫分析 和多重标记较高 第二节免疫组织(细胞)染色技术 、基本概念 免疫组织化学技术( immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术 ( immunocytochemistry)是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗 原抗体反应和化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技 术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测 各种细胞组织成分,如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体(寄 生虫、细菌病毒)、受体、神经介质、肿瘤的标记物(抗原或相关抗原)等。是 免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段 免疫组织化学的全过程包括:①抗原的提取与纯化:②免疫动物或细胞融合, 制备特异性抗体以及抗体的纯化;③将显色剂与抗体结合形成标记抗体:④组织 细胞标本的制备;⑤免疫细胞化学反应及呈色反应;⑥结果的观察与分析
标记物 检测方法 优点 缺点 应用 生物素 与各种标记物偶 联的亲和素与链 霉亲和素 保存时间长，灵 敏度高，检测手 段多样 步骤过多，存在 内源性生物素干 扰，有些底物对 人体有害 免疫组化、免疫 印迹 荧光色素 荧光显微镜或荧 光计 保存时间长，分 辨率高 自发荧光，易淬 灭 免疫组化 酶 底物显色 保存时间长，灵 敏度高，肉眼直 接可见，检测手 段多样 步骤过多，存在 内源性酶的干 扰，分辨率低， 有些底物对人体 有害 免疫组化、免疫 印迹 125I 或 131I γ 计数仪、放射 自显影 易于直接标记， 灵敏度高 半衰期短，对人 体有害 免疫印迹、定性 定量免疫分析 生物合成 放射自显影、β 计数仪 不损伤抗体、操 作简便 半衰期短，敏感 性低，需杂交瘤 细胞 免疫印迹、定性 定量免疫分析 胶体金 显微镜、电镜、 肉眼 特异性强、灵敏 度高、应用范围 广、可用于双重 和多重标记 对试剂、玻璃器 皿内的要求极 高，标记物浓度 较高 免疫组化、流式 细胞术、定性定 量免疫分析 第二节 免疫组织（细胞）染色技术 一、基本概念 免疫组 织化学 技 术 （ immunohistochemistry ） 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 （immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗 原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技 术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜 （包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测 各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄 生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等。是 免疫学、病理生理学和蛋白质研究的重要技术手段。 免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合， 制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将显色剂与抗体结合形成标记抗体；④组织 细胞标本的制备；⑤免疫细胞化学反应及呈色反应；⑥结果的观察与分析
、组织(细胞)标本的制备 (一)细胞标本的取材 1.体细胞取材方法 (1)印片法:主要用于从活组织检査标本和手术切除标本中获取细胞。首 先将标本剖开,最大程度暴露组织病变区,然后将载玻片轻压于病变组织区,吸 附脱落的细胞 (2)穿刺取样涂片法:用细针穿刺从实质性器官(如肝、肾、脾、淋巴结 软组织、骨髓)的病变区吸取病变区的体液,然后进行涂片 (3)体液沉淀涂片法:主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较 少的标本,先通过离心获取细胞沉淀,经适当稀释后再进行涂片。 2.培养细胞取材方法 (1)细胞爬片法:适合于贴壁生长的培养细胞。将干净(消毒处理)的盖 玻片放置入培养液中,细胞便会自然贴附在其上。 (2)涂片法:适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或 通过离心收集细胞,再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3.组织材料的获取主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分 为:冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 (二)细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来,让 蛋白质变性,使内源性消化酶失活。对免疫组化而言,可用的固定剂种类多样, 性能也不尽相同,在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响,防止抗原的弥 散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类(如10%的中性缓冲福尔马林,4%的多聚甲醛等)、 非醛类(如碳化二亚胺、对苯醌等)、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸 入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理,先将已 知的抗原或抗体标记上荧光素,进而再利用这种荧光抗体(或抗原)去检查细胞 或组织内的相应抗原(或抗体)。根据检测目的以及待检物的不同特点,免疫荧
二、组织（细胞）标本的制备 （一）细胞标本的取材 1．体细胞取材方法 （1）印片法：主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首 先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸 附脱落的细胞。 （2）穿刺取样涂片法：用细针穿刺从实质性器官（如肝、肾、脾、淋巴结、 软组织、骨髓）的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。 （3）体液沉淀涂片法：主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较 少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。 2．培养细胞取材方法 （1）细胞爬片法：适合于贴壁生长的培养细胞。将干净（消毒处理）的盖 玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。 （2）涂片法：适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或 通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。 3．组织材料的获取 主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分 为：冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。 （二）细胞和组织的固定 固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让 蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样， 性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥 散以及活性的丢失。 常见的固定剂有醛类（如 10％的中性缓冲福尔马林，4％的多聚甲醛等）、 非醛类（如碳化二亚胺、对苯醌等）、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸 入法和灌注法等。 三、免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已 知的抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体（或抗原）去检查细胞 或组织内的相应抗原（或抗体）。根据检测目的以及待检物的不同特点，免疫荧
光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式 (一)荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸( fluorescein-5- isothiocyanate,FTC)、四 乙基罗丹明( tetraethylrod amine B200,RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate)、藻红蛋白( phycoerythrin,PE)等,它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光 1.异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 (1)所需试剂及设备 )试剂:被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH9~9.5的碳酸 盐缓冲液(NaCO34.3g、NaCO386g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中)、PBS 缓冲液(pH72)、DMSO 2)材料与设备:透析袋、紫外分光光度计、 Sephadex g25柱等。 (2)操作步骤 1)将纯化过的抗体放入透析袋中,在加有pH9~9.5的碳酸盐缓冲液容器 中4℃透析过夜,透析后抗体被转移到一小烧杯中备用 2)配制FITC-DMSO溶液:称取适量FITC,加入DMSO溶解,使FITC终 浓度保持在1mgm左右。 3)按照适当比例将 FITC-DMSO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。(通 常,当IgG的浓度为lmgm时,FITC的加入量为5μg/ml;当IgG的浓度为 5~10mgm时FIC的加入量则降为25ug/ml)。 4)将上述标记物用PBS稀释至2.5ml,室温下避光搅拌2h 5)用 Sephadex G25柱除去游离荧光素分子,收集第一个PBS洗脱峰(荧 光素蛋白结合峰),按照下式计算F/P值 F/P=287×A495A280-0.35×A495,其中A495、A280分表代表495nm、280nm 下的光吸收值,适当的F/P值应在2~4之间。 6)分装,4℃避光保存备用。 2.四乙基罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:四乙基罗丹明(RB200)、无水丙醇、生理盐水、pH 9~9.5的碳酸盐缓冲液(同上)、透析袋和 Sephadex G50柱等
光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。 （一）荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸（fluorescein-5-isothiocyanate，FITC）、四 乙基罗丹 明（tetraethylrodamine B200 ，RB200）、四 甲基异 硫氰酸 罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate）、藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等，它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。 1．异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 （1）所需试剂及设备 1）试剂：被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9～9.5 的碳酸 盐缓冲液（Na2CO3 4.3g、NaHCO3 8.6g 溶入到终体积为 500ml 的蒸馏水中）、PBS 缓冲液（pH7.2）、DMSO； 2）材料与设备：透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25 柱等。 （2）操作步骤 1）将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有 pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液容器 中 4℃透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。 2）配制 FITC-DMSO 溶液：称取适量 FITC，加入 DMSO 溶解，使 FITC 终 浓度保持在 1mg/ml 左右。 3）按照适当比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。（通 常，当 IgG 的浓度为 1mg/ml 时，FITC 的加入量为 50µg／ml；当 IgG 的浓度为 5～10mg/ml 时,FITC 的加入量则降为 25µg／ml）。 4）将上述标记物用 PBS 稀释至 2.5ml，室温下避光搅拌 2h。 5）用 Sephadex G25 柱除去游离荧光素分子，收集第一个 PBS 洗脱峰（荧 光素蛋白结合峰），按照下式计算 F/P 值。 F/P＝2.87×A495/A280-0.35×A495，其中 A495、A280 分表代表 495nm、280nm 下的光吸收值, 适当的 F/P 值应在 2～4 之间。 6）分装，4℃避光保存备用。 2．四乙基罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：四乙基罗丹明（RB200）、无水丙醇、生理盐水、pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液（同上）、透析袋和 Sephadex G50 柱等
(2)操作步骤 1)称取lgRB200和2gPCl(五氯化磷)于研钵中仔细研磨5min后加入 loml无水乙醇不断搅拌5min,再用滤纸过滤上述溶液,所得滤液将被用于抗体 标记。(注:RB200可在PCls的作用下转变成磺酰氯SO2Cl,后者在碱性条件下 可与蛋白质的E氨基结合从而实现对抗体的标记。) 2)取抗体(浓度一般在20mg/ml左右)适量,按照每ml抗体各加入1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释,然后逐滴加入O. ImI rB200溶液,边加边 搅拌。 3)0~4℃结合12~18h,再用生理盐水透析5~7h 4)经 Sephadex G50柱层析,除去游离荧光素。 5)分装,4℃避光保存备用。 3.藻红蛋白标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体(25mg/hm1)、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂( SPDPH和SMCC):SPDP[3-(2- pyridyl thio) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester] SMCC [succ inimidyltrans-4-(N-male imidylmethy cyclohexane-l- carbox late(注:SPDP用甲醇配成1.3mg/m浓度,SMCC用甲醇 配成1.πmg/m浓度备用)、77mg/ml二硫苏糖醇(DTT)、O.lmMN-乙基顺丁烯 二酰亚胺( N-ethy male imide,NEM)、不含Ca2、Mg2+的PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25柱和 Sephacryl S-300柱等。 (2)操作步骤 1)取0.25ml保存在60%(NH)SO4中的PE(4mg/mnl),经离心弃掉上清, 并用025 mI PBs重悬。 2)将上述重悬的PE溶液在室温下用150 mI PBS透析30min,期间换液两次 3)调整透析后的PE溶液浓度在14mgm(共约有0.7ml体积),加入16μul SPDP,室温孵育2~3h。 4)取纯化的抗体lm(2.5mg/ml),加入20μ I SMCC溶液,室温孵育1h, 制备SMCC-抗体交联物。 5)加入30山lDTT溶液到第三步交联好的SPDP-PE中,室温孵育30min。 6)用 Sephadex g25柱层析纯化SPDP-PE和SMCC-抗体交联物
（2）操作步骤 1）称取 1g RB200 和 2g PCl5（五氯化磷）于研钵中仔细研磨 5min 后加入 10ml 无水乙醇不断搅拌 5min，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体 标记。（注：RB200 可在 PCl5 的作用下转变成磺酰氯 SO2Cl，后者在碱性条件下 可与蛋白质的 ε-氨基结合从而实现对抗体的标记。） 2）取抗体（浓度一般在 20mg/ml 左右）适量，按照每 ml 抗体各加入 1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入 0.1ml RB200 溶液,边加边 搅拌。 3）0～4℃结合 12～18h，再用生理盐水透析 5～7h。 4）经 Sephadex G50 柱层析，除去游离荧光素。 5）分装，4℃避光保存备用。 3．藻红蛋白标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体（2.5mg/ml）、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂（SPDPH 和 SMCC）：SPDP[3-（2-pyridyldithio）propionic acid N-hydroxysuccinimide ester]、SMCC [succinimidyltrans-4-（N-maleimidylmethy） cyclohexane-1-carboxlate]（注：SPDP 用甲醇配成 1.3mg/ml 浓度，SMCC 用甲醇 配成 1.7mg/ml 浓度备用）、77mg/ml 二硫苏糖醇（DTT）、0.1mM N-乙基顺丁烯 二酰亚胺（N-ethy maleimide，NEM）、不含 Ca2＋、Mg2＋的 PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25 柱和 Sephacryl S-300 柱等。 （2）操作步骤 1）取 0.25ml 保存在 60％(NH)4SO4 中的 PE（4mg/ml），经离心弃掉上清， 并用 0.25ml PBS 重悬。 2）将上述重悬的 PE 溶液在室温下用 150ml PBS 透析 30min，期间换液两次。 3）调整透析后的 PE 溶液浓度在 1.4mg/ml（共约有 0.7ml 体积），加入 16µl SPDP，室温孵育 2～3h。 4）取纯化的抗体 1ml（2.5mg/ml），加入 20µl SMCC 溶液，室温孵育 1h， 制备 SMCC-抗体交联物。 5）加入 30µl DTT 溶液到第三步交联好的 SPDP－PE 中，室温孵育 30min。 6）用 Sephadex G25 柱层析纯化 SPDP－PE 和 SMCC-抗体交联物
7)将纯化后的 SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合,4℃振荡过夜 8)加入80μ的0.lmMN-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30min,终止 反应 9)利用 Sephacryl-300柱层析分离纯化PE标记的抗体,用PBS洗脱,收 集第一个洗脱峰。 10)分装,4℃避光保存备用 4.四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01MPBS (pH80)、DMSO、pH9-9.5的碳酸盐缓冲液(同前)、透析袋、Bio-GelP-6层 析柱等。 (2)操作步骤 1)取1om抗体(6mgm)入透析袋在pH9-95的碳酸盐缓冲液中透析过 夜,将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2)称取四甲基异硫氰酸罗丹明lmg,用DMSO溶解制成浓度为lmgm的 溶液。 3)取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300u逐滴加入到透析过的抗体溶液 中,室温下避光搅拌2h 4)Bio-GelP6层析柱,用PBS洗脱,收集先流出的红色结合物。 5)分装,4℃避光保存备用 (二)免疫荧光细胞化学染色方法 直接法 (1)染色:给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体,在室温或37℃孵育30min。染色的整个过程,切片应被放置在湿盒中。 (2)洗片:首先倾倒掉存留的荧光抗体,然后用pH7.2或pH74的0.01M BS洗涤两次,每次5min,最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 (3)用50%缓冲(0.5M的磷酸盐缓冲液,pH9~95)甘油封固玻片,镜 检 2.间接法 常用的间接法主要有两种:双层法和夹心法
7）将纯化后的 SPDP-PE 和 SMCC-抗体交联物混合，4℃振荡过夜。 8）加入 80µl 的 0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育 30min，终止 反应。 9）利用 Sephacryl S-300 柱层析分离纯化 PE 标记的抗体，用 PBS 洗脱，收 集第一个洗脱峰。 10）分装，4℃避光保存备用。 4．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01M PBS （pH 8.0）、DMSO、pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液（同前）、透析袋、Bio-Gel P-6 层 析柱等。 （2）操作步骤 1）取 10ml 抗体（6mg/ml）入透析袋在 pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液中透析过 夜，将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2）称取四甲基异硫氰酸罗丹明 1mg，用 DMSO 溶解制成浓度为 1mg/ml 的 溶液。 3）取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液 300µl 逐滴加入到透析过的抗体溶液 中，室温下避光搅拌 2h。 4）Bio-Gel P-6 层析柱，用 PBS 洗脱，收集先流出的红色结合物。 5）分装，4℃避光保存备用。 （二）免疫荧光细胞化学染色方法 1．直接法 （1）染色：给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体，在室温或 37℃孵育 30min。染色的整个过程，切片应被放置在湿盒中。 （2）洗片：首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用 pH 7.2 或 pH 7.4 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 （3）用 50％缓冲（0.5M 的磷酸盐缓冲液，pH 9～9.5）甘油封固玻片，镜 检。 2．间接法 常用的间接法主要有两种：双层法和夹心法
(1)双层法 1)吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切(涂、爬)片上,在 染色用的湿盒中37℃孵育30min。 2)用pH72的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体 3)滴加荧光标记的二抗,置于湿盒中37℃孵育30min,再用PBS洗涤两次, 每次5min,用吸水纸吸去残留的液体 4)缓冲甘油封固,镜检 (2)夹心法:是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法 1)滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切(涂)片上,在 染色用的湿盒中37℃孵育30min 2)用pH72的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3)滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体,置于湿盒中37℃孵育30min 4)用pH7.2的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 5)缓冲甘油封镜,镜检。 (三)免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等 进行检测 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术,借助于酶细胞化学技术 而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要 形式。 (一)酶标抗体法 1.酶标抗体的制备可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点:①酶催化 的底物必须是特异性的,容易被显示,易于在光镜下或电镜下观察;②用于免疫 化学的酶要易于获得,便于商品化和标准化;③在中性pH值时,酶应比较稳定, 标记在抗体上的酶应在1~2年内活性不变;④所形成的终产物沉淀必须稳定
（1）双层法 1）吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切（涂、爬）片上，在 染色用的湿盒中 37℃孵育 30min。 2）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3）滴加荧光标记的二抗，置于湿盒中 37℃孵育 30min，再用 PBS 洗涤两次， 每次 5min，用吸水纸吸去残留的液体。 4）缓冲甘油封固，镜检。 （2）夹心法：是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法。 1）滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切（涂）片上，在 染色用的湿盒中 37℃孵育 30min。 2）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3）滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体，置于湿盒中 37℃孵育 30min。 4）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 5）缓冲甘油封镜，镜检。 （三）免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等 进行检测。 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术，借助于酶细胞化学技术 而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要 形式。 （一）酶标抗体法 1．酶标抗体的制备 可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点：①酶催化 的底物必须是特异性的，容易被显示，易于在光镜下或电镜下观察；②用于免疫 化学的酶要易于获得，便于商品化和标准化；③在中性 pH 值时，酶应比较稳定， 标记在抗体上的酶应在 1～2 年内活性不变；④所形成的终产物沉淀必须稳定
不能从酶活性部位向周围组织弥散,而影响组织学定位;⑤酶与抗体的连接不能 影响抗体的活性;⑥在被检测的细胞或组织中,不能存在与标记酶相同的内源性 酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase HRP)、碱性磷酸酶( alkaline phosphatase,ALP)、葡萄糖氧化酶( glucose oxidase GOD)等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同,它需借助偶联剂的作用将酶 链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、 male im ide等。这些偶 联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用,因而是不可逆的,同时,偶联剂的加 入还应不影响酶和抗体的活性,不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非 特异性结合。 2.染色方法酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种,以间接法为 主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 (1)细胞组织切(涂、爬)片的准备与固定 (2)用PBS或其他缓冲液洗涤切片三次,每次2min,溶解除去冰冻切片上 的OCT包埋剂。(但当应用ALP标记的抗体时,应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤, 因为后者可使ALP失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步)。 (3)根据需要,用甲醇+0.3%过氧化氢处理切片15~30min,封闭内源性 氧化酶的作用,PBS洗涤两次,每次2min。(应用ALP标记的抗体时可省略此 过程)。 (4)在室温条件下,将切片放入到含005% Tween-20的PBS缓冲液中处理 5min,以增强组织的通透性 (5)用4%的 Block ace或0.01%~1%的BSA在适合中孵育切片15~25min, 以阻断抗体与组织的非特应性结合。 (6)轻轻弃掉上述孵育液,根据需要滴加含0.2%BSA,005%NaN3的经 PBS稀释的一抗。通常,每片滴加50~80μu,室温下湿盒中孵育1~2h,免疫电 镜标本需要在4℃下过夜。(注:此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染)。 (7)PBS洗涤三次,每次2min,以除去非特异性结合的吸附抗体 (8)用含005% TWeen-20的PBS缓冲液洗涤2min后,滴加含0.2%BSA, 1%正常血清的经PBS稀释的HRP酶标二抗,室温下湿盒内孵育45~60min
不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位；⑤酶与抗体的连接不能 影响抗体的活性；⑥在被检测的细胞或组织中，不能存在与标记酶相同的内源性 酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase， GOD）等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同，它需借助偶联剂的作用将酶 链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、maleimide 等。这些偶 联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用，因而是不可逆的，同时，偶联剂的加 入还应不影响酶和抗体的活性，不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非 特异性结合。 2．染色方法 酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种，以间接法为 主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 （1）细胞组织切（涂、爬）片的准备与固定。 （2）用 PBS 或其他缓冲液洗涤切片三次，每次 2min，溶解除去冰冻切片上 的 OCT 包埋剂。（但当应用 ALP 标记的抗体时，应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤， 因为后者可使 ALP 失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步）。 （3）根据需要，用甲醇＋0.3%过氧化氢处理切片 15～30min，封闭内源性 氧化酶的作用，PBS 洗涤两次，每次 2min。（应用 ALP 标记的抗体时可省略此 过程）。 （4）在室温条件下，将切片放入到含 0.05%Tween-20 的 PBS 缓冲液中处理 5min，以增强组织的通透性。 （5）用4％的Block Ace或0.01%～1%的BSA在适合中孵育切片15～25min， 以阻断抗体与组织的非特应性结合。 （6）轻轻弃掉上述孵育液，根据需要滴加含 0.2%BSA，0.05% NaN3 的经 PBS 稀释的一抗。通常，每片滴加 50～80µl，室温下湿盒中孵育 1～2h，免疫电 镜标本需要在 4℃下过夜。（注：此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染）。 （7）PBS 洗涤三次，每次 2min，以除去非特异性结合的吸附抗体。 （8）用含 0.05%Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 2min 后，滴加含 0.2%BSA， 1％正常血清的经 PBS 稀释的 HRP 酶标二抗，室温下湿盒内孵育 45～60min
(9)PBS洗涤三次,每次2min (10)显色:HRP标记抗体的显色剂为含有0.01-0.1%H202、001-0.05%DAB、 001-0. IM Tris-HCI(pH74)的缓冲液。切片经PBS漂洗后,在室温黑暗条件下 置入上述显色液中显色,镜检控制显色时间与速度 (11)流水或PBS终止显色 (12)系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固、镜检。 (二)非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由 Sternberger等在酶标法的基础上发展而成,能有效降低 背景,能最大程度保留抗体的活性,灵敏度高。主要有酶桥法(ε nzy me bridge method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法( peroxidase antiperoxidase method,PAP), 又以后者的应用较为广泛 这两种方法均需先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体,然后 在第二抗体(亦称桥抗体)的作用下,将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第 一抗体连结起来,进而再将酶结合在抗酶抗体,最后经呈色反应来显示抗原的分 布。所不同的是,在PAP法中,通常先让抗酶抗体与酶形成复合物(如PAP复 合物),然后在桥抗体的帮助下,一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中,任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, 避免了共价连结对抗体和酶活性的损害,同时还提高了方法的敏感性,且能节省 第一抗体的用量 1.PAP的制备在离体条件下制备HRP与抗HRP的复合物(PAP复合物) 的主要步骤如下。 (1)按常规免疫学方法制备抗HRP血清。 (2)制备PAP复合物。所需试剂包括:1mg/ ml HRP溶液、2mg/ mlHRP溶 液、生理盐水、O. IMHCI、 IMHCI、0. IMNaOH、 IMNaOH、饱和硫酸铵溶液 50%硫酸铵溶液、透析液(486 g Nacl,1,5 MNaoocch3oml,1,5M(NH4)SO 30ml,水594L)等:其步骤为 1)取10.50m抗HRP血清,加760 ml HRP水溶液(lmg/ml),混匀后,室 温放置1h。 2)4℃,16000g离心15min,小心弃掉上清
（9）PBS 洗涤三次，每次 2min。 （10）显色：HRP 标记抗体的显色剂为含有 0.01-0.1%H202、0.01-0.05%DAB、 0.01-0.1M Tris-HCl（pH7.4）的缓冲液。切片经 PBS 漂洗后，在室温黑暗条件下 置入上述显色液中显色，镜检控制显色时间与速度。 （11）流水或 PBS 终止显色。 （12）系列乙醇脱水、Hemo-De 透明、DPX 封固、镜检。 （二）非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由 Sternberger 等在酶标法的基础上发展而成，能有效降低 背景，能最大程度保留抗体的活性，灵敏度高。主要有酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method, PAP）， 又以后者的应用较为广泛。 这两种方法均需先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后 在第二抗体（亦称桥抗体）的作用下，将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第 一抗体连结起来，进而再将酶结合在抗酶抗体，最后经呈色反应来显示抗原的分 布。所不同的是，在 PAP 法中，通常先让抗酶抗体与酶形成复合物（如 PAP 复 合物），然后在桥抗体的帮助下，一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合， 避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，同时还提高了方法的敏感性，且能节省 第一抗体的用量。 1．PAP 的制备 在离体条件下制备 HRP 与抗 HRP 的复合物（PAP 复合物） 的主要步骤如下。 （1）按常规免疫学方法制备抗 HRP 血清。 （2）制备 PAP 复合物。所需试剂包括：1mg/ml HRP 溶液、2mg/ml HRP 溶 液、生理盐水、0.1M HCl、1M HCl、0.1M NaOH、1M NaOH、饱和硫酸铵溶液、 50％硫酸铵溶液、透析液（48.6g NaCl, 1.5M NaOOCCH3 30ml, 1.5M (NH4)2SO4 30ml, 水 5.94L）等；其步骤为： 1）取 10.50ml 抗 HRP 血清，加 7.60ml HRP 水溶液（1mg/ml），混匀后，室 温放置 1h。 2）4℃，16000g 离心 15min，小心弃掉上清
3)用预冷的生理盐水溶解沉淀,4℃,16000g离心15min,重复4次。 4)加15、3 ml HrP水溶液(2mg/ml),室温,持续搅拌Ih 5)用1MHCl及0. IM HCI调p至2.3,沉淀物全部溶解变清,立即用IM 及0. MNaOh调pH至72。 6)慢慢加等体积的饱和硫酸铵,O℃放置45min 7)0℃,35000g离心15min,所得沉淀用50%硫酸铵洗涤两次 8)用10.50ml水溶解沉淀,置入透析袋中4℃透析过夜。 9)4℃离心,收集上清,加适量透析液使体积至10.50ml,分装后于4℃保 2.PAP染色方法染色步骤包括:①切片准备及第一抗体孵育前处理步骤 同酶标抗体染色间接法的1~5步;②切片与特异性一抗4℃孵育24h;③用过量 的桥抗体孵育;④用离体制得的PAP复合物(常作1:30~300稀释)室温下孵 育1~1.5h,使其能够被桥抗体连结在第一抗体上;⑤用DAB-H2O2液显色,镜 下控制显色程度;⑥系列酒精脱水,二甲苯透明,DPⅹ封固,镜检 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用,一些新的技术创新也不断涌现。其中最 具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素( lectin)、生物 素( biotin)和葡萄球菌A蛋白( staphylococcal protein A,SPA)等被应用于免 疫细胞化学技术,从而建立了SPA-HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等一 些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、 氧化和还原,另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此, Bayer在1976 年将其命名为亲合组织化学( affinity histochemistry)。 目前,亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌 A蛋白与IsG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用,所以,抗原抗体反应 亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学 的敏感性得到进一步提高,更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原(或抗体) 的定位进行研究 现以抗生物素生物素免疫细胞化学染色为例,简要介绍亲和组织化学技术
3）用预冷的生理盐水溶解沉淀，4℃，16000g 离心 15min，重复 4 次。 4）加 15.3ml HRP 水溶液（2mg/ml），室温，持续搅拌 1h。 5）用 1M HCl 及 0.1M HCl 调 pH 至 2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用 1M 及 0.1M NaOH 调 pH 至 7.2。 6）慢慢加等体积的饱和硫酸铵，0℃放置 45min。 7）0℃，35000g 离心 15min，所得沉淀用 50%硫酸铵洗涤两次。 8）用 10.50ml 水溶解沉淀，置入透析袋中 4℃透析过夜。 9）4℃离心，收集上清，加适量透析液使体积至 10.50ml，分装后于 4℃保 存。 2．PAP 染色方法 染色步骤包括：①切片准备及第一抗体孵育前处理步骤 同酶标抗体染色间接法的 1～5 步；②切片与特异性一抗 4℃孵育 24h；③用过量 的桥抗体孵育；④用离体制得的 PAP 复合物（常作 1:30～300 稀释）室温下孵 育 1～1.5h，使其能够被桥抗体连结在第一抗体上；⑤用 DAB-H2O2 液显色，镜 下控制显色程度；⑥系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX 封固，镜检。 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用，一些新的技术创新也不断涌现。其中最 具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（lectin）、生物 素（biotin）和葡萄球菌 A 蛋白（staphylococcal protein A，SPA）等被应用于免 疫细胞化学技术，从而建立了 SPA-HRP 法、ABC 法、BRAB 法和 LAB 法等一 些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、 氧化和还原，另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此，Bayer 在 1976 年将其命名为亲合组织化学（affinity histochemistry）。 目前，亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌 A 蛋白与 IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用，所以，抗原抗体反应 亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学 的敏感性得到进一步提高，更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原（或抗体） 的定位进行研究。 现以抗生物素-生物素免疫细胞化学染色为例，简要介绍亲和组织化学技术