实验(三) 细胞损伤与保护3 凋亡相关基因-Bax 在不同细胞中表达产物差异检测
凋亡相关基因－Bax 在不同细胞中表达产物差异检测 实验（三） 细胞损伤与保护3
原理 免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其所带有 的特殊标记物的显示,籍以对细胞内某抗原或抗 体作定性、定位以及定量检测 亲和组织化学:则将一些具有双价或多价结 合力的物质(生物素),应用于免疫组化,使得抗原 抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高 灵敏性和高特异性
原 理 免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有 的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗 体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结 合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原 抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高 灵敏性和高特异性
原理 Bax ■凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变(寡聚化) 作用线粒体膜,使其膜通透性增加,释放 Cytc,细胞凋亡
原 理 Bax—— ◼ 凋亡相关基因 ◼ Bcl-2家族成员 ◼ 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化） ◼ 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放 Cytc，细胞凋亡
原理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原,用小 鼠特异性抗体(一抗)与其结合,再用生 物素标记的羊抗小鼠抗体(二抗)与前者 结合,形成了生物素复合物 此复合物与SABC作用,使得检测物被 放大,最后在显色剂DAB的作用下,Bax构 象蛋白显色(褐色)
原 理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小 鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生 物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者 结合，形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用，使得检测物被 放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构 象蛋白显色（褐色）
器材与试剂 仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、 SABC、DAB、0.3%H2O2-PBS
器材与试剂 仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3％H2O2 -PBS
试剂说明 PBS:磷酸盐缓冲液(0.01Mp74) 时闭液:山羊血清(或BSA),用时PBS稀释 抗:小鼠gG,用时PBS稀释 抗:生物素标记的羊抗小鼠IgG 0.3%H2O2-PBS(甲醇) 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC( avidin- biotin- peroxidase complex链酶亲和素 生物素——过氧化物酶复合物): 抗生物素,起到放大作用 DAB( diaminobenzidine)显色液: 3,3′-二氨基联苯胺
试 剂 说 明 ◼ PBS： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 ） ◼ 封闭液： 山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释 ◼ 一 抗： 小鼠IgG，用时PBS稀释 ◼ 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠IgG ◼ 0.3％ H2O2 -PBS（甲醇） 消除内源性过氧化物酶活性作用 ◼ SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 ——生物素——过氧化物酶复合物) ： 抗生物素，起到放大作用 ◼ DAB(diaminobenzidine)显色液： 3,3´-二氨基联苯胺
实验步骤 ■培养细胞(96孔板,每组3正常、3损伤、3损伤恢复) PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤) ■甲醇固定10min ■PBS洗3次(轻轻地洗涤) 加入封闭液(1:10)25μ,37℃,30mn以上 加一抗(1:300)25μ,37℃,1h以上(或4℃过夜) PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤) 加二抗(1 mI Pbs加入生物素化山羊抗小鼠IgG10) 25{,37℃,1h以上 ■PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)
实验步骤 ◼ 培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复） ◼ PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) ◼ 甲醇固定10min ◼ PBS 洗3次 (轻轻地洗涤) ◼ 加入封闭液（1:10） 25µl，37 ℃，30min以上 ◼ 加一抗（1:300）25µl，37℃，1h以上 (或4℃过夜) ◼ PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) ◼ 加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl） 25µl，37 ℃，1h以上 ◼ PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤)
实验步骤 加0.3%H2O2-PBS/甲醇,37℃,30min PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤) SABC工作液(1 mI PBs加入SABC10,混匀)20 30μ,37℃,30分钟 PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤) DAB显色 DAB显色工作液配制(现配):1ml蒸馏水,加试 剂盒中A、B、C试剂各50u,混匀后加至细胞孔板, 镜下控制,以蒸馏水终止反应。 观察结果
实验步骤 ◼ 加0.3％ H2O2 -PBS/甲醇，37 ℃，30min ◼ PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) ◼ SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10µl，混匀）20- 30µl，37 ℃，30分钟 ◼ PBS 洗3次 (轻轻地摇动洗涤) ◼ DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试 剂盒中A、B、C试剂各50ul，混匀后加至细胞孔板， 镜下控制，以蒸馏水终止反应。 ◼ 观察结果
实验结果 缺糖前Hela细胞
实验结果 缺糖前 Hela 细胞
缺糖24 n hela细胞
缺糖 24h Hela细胞