第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控 进行研究,是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中,逐步建立起 系列行之有效的技术。针对不同的研究内容,可建立不同的研究路线。 第一节PCR技术 聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)技术是一种体外核酸扩增 技术,具有特异、敏感、产率髙、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完 善,成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使 特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段 可以直接通过电泳观察,并作进一步的分析 、实验原理 PCR是根据DNA变性复性的原理,通过特异性引物,完成特异片段扩增。 第一,按照欲检测的DNA的5′和3′端的碱基顺序各合成一段长约18~24个 碱基的寡核苷酸序列作为引物( primer)。引物设计需要根据以下原则:①引物 的长度保持在18~24bp之间,引物过短将影响产物的特异性,而引物过长将影 响产物的合成效率;②GC含量应保持在45~60%之间;③5′和3′端的引物间 不能形成互补。第二,将待检测的DNA变性后,加入四种单核苷酸(dNTP) 引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性,在进入较低的温度使引物 与待扩增的DNA链复性结合,然后在聚合酶的作用下,体系中的脱氧核苷酸与 模板DNA链互补配对,不断延伸合成新互补链,最终使一条DNA双链合成为 两条双链。通过变性(92~95℃)→复性(40~60℃)→引物延伸(65~72℃) 的顺序循环20至40个周期,就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周 期可使DNA扩增100余万倍
第二篇 细胞的遗传物质 第三章 基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控 进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一 系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。 第一节 PCR 技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增 技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR 技术日斟完 善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用 PCR 技术可以使 特定的基因或 DNA 片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段 可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。 一、实验原理 PCR 是根据 DNA 变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。 第一，按照欲检测的 DNA 的 5＇和 3＇端的碱基顺序各合成一段长约 18～24 个 碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：①引物 的长度保持在 18～24bp 之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影 响产物的合成效率；②GC 含量应保持在 45～60%之间；③5＇和 3＇端的引物间 不能形成互补。第二，将待检测的 DNA 变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、 引物和耐热 DNA 聚合酶以及缓冲液。通过 95℃变性，在进入较低的温度使引物 与待扩增的 DNA 链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与 模板 DNA 链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条 DNA 双链合成为 两条双链。通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃） 的顺序循环 20 至 40 个周期，就可以得到大量的 DNA 片段。理论上循环 20 周 期可使 DNA 扩增 100 余万倍
、PCR技术的分类及其应用范围 1.逆转录PCR逆转录PCR( RT-PCR)是将RNA反转录和PCR结合而 建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程:通过逆转录合成cDNA和对之进 行PCR扩增。其中,用于逆转录的RNA模板要求完整,并且不含DNA和蛋白 质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。 2.原位PCR原位PCR技术( in situ pcr)是将检测细胞内特定基因的原 位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞 内微量的基因,并将其检测出来的技术。 3.甲基化PCR甲基化PCR与常规PCR在原理上一致,但在引物的设计 以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域,一般需要设 计三条引物:正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三 组PCR,判断DNA序列中甲基化的存在与否 4.实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR( real time quantitative PCr)是 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进 程,并能对起始模板进行定量分析。 RT-PCR需要荧光探针参与,常用的探针可 分为以下几类:1)内掺式染料 SYBR Green I:2)序列特异性探针: Taqman Molecular beacons, Dual probes;3)特异性引物: Amplifluor( Intergen),Lux 引物, Scorpion;4)阴阳探针。 荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量,用于临床诊断,而且可以应用不同 的探针检测基因突变和SNP分析。 5.多重引物PCR多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物,同时扩 增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或 同一疾病的几个不同的基因突变 6.随机引物PCR多态DNA的随机扩增( random amplication of polymorphic DNA,RAPD)或随机引物PCR( arbitrarily primed PCR, AP PCR 是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物,通过PCR扩增产生一组代表种 或株特性的DNA片段。因此,RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通 用方法 7.套式PCR又称巢式PCR,是对靶DNA片段设计两套引物系统,第1
二、PCR 技术的分类及其应用范围 1．逆转录 PCR 逆转录 PCR（RT-PCR）是将 RNA 反转录和 PCR 结合而 建立起来的一种 PCR 技术。其包括两个过程：通过逆转录合成 cDNA 和对之进 行 PCR 扩增。其中，用于逆转录的 RNA 模板要求完整，并且不含 DNA 和蛋白 质等杂质。逆转录 PCR 可以检测低于 10 个拷贝的特异 RNA。 2．原位 PCR 原位 PCR 技术（in situ PCR）是将检测细胞内特定基因的原 位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞 内微量的基因，并将其检测出来的技术。 3．甲基化 PCR 甲基化 PCR 与常规 PCR 在原理上一致，但在引物的设计 以及 DNA 样本的处理上有所不同。针对扩增的 DNA 甲基化区域，一般需要设 计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及 DNA 序列修饰引物。通过三 组 PCR，判断 DNA 序列中甲基化的存在与否。 4．实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR（real time quantitative PCR）是 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个 PCR 进 程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR 需要荧光探针参与，常用的探针可 分为以下几类：1）内掺式染料 SYBR Green I；2）序列特异性探针：Taqman， Molecular Beacons， Dual Probes； 3）特异性引物： Amplifluor（Intergen）， Lux 引物， Scorpion； 4）阴阳探针。 荧光定量 PCR 不仅可以测定靶 DNA 的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同 的探针检测基因突变和 SNP 分析。 5．多重引物 PCR 多重引物 PCR 是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩 增多个基因片段的 PCR 技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或 同一疾病的几个不同的基因突变。 6．随机引物 PCR 多态 DNA 的随机扩增 （random amplication of polymorphic DNA，RAPD）或随机引物 PCR（arbitrarily primed PCR，AP PCR） 是应用基因组 DNA 中单一、随机序列的短引物，通过 PCR 扩增产生一组代表种 或株特性的 DNA 片段。因此，RAPD 是获得种或株的 DNA 分子指纹图谱的通 用方法。 7．套式 PCR 又称巢式 PCR，是对靶 DNA 片段设计两套引物系统，第 1
套引物扩增15~30个循环,再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增15~ 30个循环,可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非 特异性扩增,增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。 8.突变体构建PCR (1)应用载体构建突变体的PCR:原理是将野生型目的基因的cDNA插入 到克隆载体上,设计携带突变点的一对引物,对克隆载体进行扩増,然后将经过 PCR而获得的DNA转染感受态细胞,并用筛选培养基筛选转染的细胞,获得的 克隆可以通过细胞扩增,获得大量的携带突变体DNA的载体。 (2)应用内外引物构建突变体的PCR:载体构建突变体PCR是构建点突变 的高效方法,但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体 PCR可以克服载体构建突变体PCR的不足。其原理是合成两对引物,即一对扩 增整个cDNA的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个 外引物与一个内引物进行PCR,可以获得两条DNA序列,该两条DNA在突变 位点存在部分重合。去除引物,将两条DNA变性,而后进行复性,将可导致两 条DNA重合部分互补,并在Taq酶的作用下补齐3′末端。用外引物扩增DNA, 将获得含有突变的cDNA。 PCR引物的设计是PCR成功的关键,必须遵守以下原则:①确定扩增区域 及其长度;②确定引物的Tm值;③避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹 结构等二级结构的形成;④具有扩增的特异性 三、应用PCR技术检测性别决定基因 (一)实验原理 SRY基因又称睾丸决定基因( Testis determ ining factor),位于人类Y染色体, 在ⅹ染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物, 通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段,以及患者的表型可对患者的 真正性别和病因作出判断,另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病 患儿的出生。 (二)实验准备 1.材料人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、15m及0.5 ml Eppendorf 管。引物序列:(SRY:5′ GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAG TG-3’;SRY2
套引物扩增 15～30 个循环，再用扩增的 DNA 片段内设定的第 2 套引物扩增 15～ 30 个循环，可使目的 DNA 序列得到高效扩增。套式引物 PCR 可减少引物的非 特异性扩增，增加特异性扩增,减少 PCR 的误诊率。 8．突变体构建 PCR （1）应用载体构建突变体的 PCR：原理是将野生型目的基因的 cDNA 插入 到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过 PCR 而获得的 DNA 转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的 克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体 DNA 的载体。 （2）应用内外引物构建突变体的 PCR：载体构建突变体 PCR 是构建点突变 的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体 PCR 可以克服载体构建突变体 PCR 的不足。其原理是合成两对引物，即一对扩 增整个 cDNA 的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个 外引物与一个内引物进行 PCR，可以获得两条 DNA 序列，该两条 DNA 在突变 位点存在部分重合。去除引物，将两条 DNA 变性，而后进行复性，将可导致两 条 DNA 重合部分互补，并在 Taq 酶的作用下补齐 3＇末端。用外引物扩增 DNA， 将获得含有突变的 cDNA。 PCR 引物的设计是 PCR 成功的关键，必须遵守以下原则：①确定扩增区域 及其长度；②确定引物的Ｔｍ值；③避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹 结构等二级结构的形成；④具有扩增的特异性。 三、应用 PCR 技术检测性别决定基因 （一）实验原理 SRY 基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类 Y 染色体， 在 X 染色体上没有相应的同源节段。根据 SRY 基因序列合成一对特异性引物， 通过 PCR 反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的 真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病 患儿的出生。 （二）实验准备 1. 材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml 及 0.5ml Eppendorf 管。引物序列：（SRY1：5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′；SRY2：
5'-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3' 2.试剂(实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理) 生理盐水、细胞裂解液(50 mmol tris-HCl,pH8.0; I mmol na2EDTA,pH 80:05%SDS;0.1 mmol naCl)、10mg/ml蛋白酶K、20%SDS、水饱和酚(1mo Tris-HCl抽提)、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)、8mol 醋酸钾、无水乙醇、0%乙醇、TE(pH80)(l0 mmolL Tris-HC,pH8.0;0.1 mmol/L Na2EDtA,pH80)、10× buffer( 500mmol/L KCl、100 mmol/L TrisHCl,pH8.3, 室温15 mmol/L MgCh2;0.1%明胶)、4×dNTP(1 mmol/LdAP,1mmo/ L dcTP 1 mmol/l dGTP,1 mmol/l dTTP)、Taq酶(lU/μl1)、引物溶液(l0 pmol/ul)、5×TBE 缓冲液(1000ml)(54 g Tris碱,27.5g硼酸,20ml0.5 MOIL EDTA,pH8.0)、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液(l0oσm〕(0.2%溴酚蓝,50%蔗糖, l0 mol/l Naoh1~2滴)、10mgml溴化乙锭溶液(戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg,放入棕色瓶中,加重蒸水20m,溶解后置4℃冰箱保存备用。使用时100n 琼脂糖凝胶中加5μll0mg/ml溴化乙锭溶液,终浓度为0.5ugml)。 3.实验仪器PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 (三)实验步骤 1.DNA模板制备 方法I:取毛发1~2根,尽量剪碎,于15~20m生理盐水中100℃水浴10min 离心取上清备用。 方法Ⅱ:外周血提取DNA (1)白细胞的分离 ①抗凝血用1~2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水(PBS)稀释并混合。 ②在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),在上面 仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。 ③室温以2000pm离心15min~20min,红细胞应沉于管底,而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆,小心吸取淋巴细胞层,直至把淋巴细胞转移完全 ⑤用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次
5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′） 2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理） 生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na2 EDTA ，pH 8.0；0.5% SDS；0.1mmol NaCl）、10mg/ml 蛋白酶 K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L Na2EDTA，pH8.0）、10×buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·HCl，pH8.3， 室温 15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4×dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP， 1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/μl）、引物溶液（10pmol/μl）、5×TBE 缓冲液（1000ml）（54g Tris 碱，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖， 10mol/L NaOH 12 滴）、10mg/ml 溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水 20ml，溶解后置 4℃冰箱保存备用。使用时 100ml 琼脂糖凝胶中加 5μl 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为 0.5μg/ml）。 3. 实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 （三）实验步骤 1. DNA 模板制备 方法Ⅰ：取毛发 12 根，尽量剪碎，于 1520ml 生理盐水中 100℃水浴 10min， 离心取上清备用。 方法Ⅱ：外周血提取 DNA （1）白细胞的分离 ①抗凝血用 1～2 倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 ②在 50ml 离心管中加入 1 倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面 仔细铺一层 2 倍体积已稀释的血液。 ③室温以 2000rpm 离心 15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。 ⑤用生理盐水或 PBS 洗淋巴细胞二次
⑥最后得到的淋巴细胞沉淀,可立即用于DNA的提取,或冻存于超低温冰 箱中,直至使用。 (2)DNA的提取(见本篇第一章)。 2.PCR反应体系配制及扩增 (1)PCR反应总体积50ul,取一洁净的0.5 ml Eppendorf管,依次加入: 0× buffer dNTP 5ul 引物1 引物2 2.5u 模板DNA 10ul Taq dna daHaO 补足50ul (2)将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应,条件为94℃变性10min 后,94℃45s、55℃45s、72℃90s共30个循环;最末一个循环紧接72℃再延伸 l0min。 3.扩增产物电泳检测 取PCR扩增产物10ul与2山l上样缓冲液混合后,与 DNA Marker同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束,取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 (四)注意事项 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2.PCR常见问题及解决办法 (1)没有得到预期的PCR扩增产物:①确证聚合酶的活性是否正常;② DNA解链是否充分,变性温度是否准确;③引物组成是否正确,有无二级结构 组成;④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在,使聚合酶或模板及产物降解。 (2)有非特异性扩增产物出现:①增加复性温度,缩短复性时间及延伸时 间;②降低引物和 Taq dna聚合酶的用量;③调整Mg2+浓度;④减少热循环次 (3)形成了引物二聚体:①检查引物的序列,特别是3′端是否有互补区
⑥最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于 DNA 的提取，或冻存于超低温冰 箱中，直至使用。 （2）DNA 的提取（见本篇第一章）。 2. PCR 反应体系配制及扩增 （1）PCR 反应总体积 50μl，取一洁净的 0.5ml Eppendorf 管，依次加入： 10×buffer 5μl dNTP 5μl 引物 1 2.5μl 引物 2 2.5μl 模板 DNA 10μl Taq DNA 2U d3H2O 补足 50μl （2）将反应管放入 PCR 扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为 94℃变性 10min 后，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 90s 共 30 个循环；最末一个循环紧接 72℃再延伸 10min。 3. 扩增产物电泳检测 取 PCR 扩增产物 10μl 与 2μl 上样缓冲液混合后，与 DNA Marker 同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 （四）注意事项 1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2. PCR 常见问题及解决办法 （1）没有得到预期的 PCR 扩增产物：①确证聚合酶的活性是否正常；② DNA 解链是否充分，变性温度是否准确；③引物组成是否正确，有无二级结构 组成；④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。 （2）有非特异性扩增产物出现：①增加复性温度，缩短复性时间及延伸时 间；②降低引物和 Taq DNA 聚合酶的用量；③调整 Mg2+浓度；④减少热循环次 数。 （3）形成了引物二聚体：①检查引物的序列，特别是 3′端是否有互补区；
②增加引物的长度;③调整引物与模板浓度,使模板比例増髙,降低引物使用浓 度;④增加复性温度;⑤减少热循环次数。 (4)PCR产物在凝胶电泳中成片状:①减少 Taq dna聚合酶的用量:②增 加复性温度,减少复性时间及延伸时间;③降低Mg2浓度;④减少循环次数: ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA,再次进行PCR反应 3.实验安全 溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套,这些溶液经使用后,应进行净化处理 第二节单链构象多态性(SSCP)分析 单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是 利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点,结合PCR进行基因检测的一种 分析技术,称为 PCR-SSCP技术。其基本原理为:DNA或cDNA在变性后,由 于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中,不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此, PCR-SSCP可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域 PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低,在检测200个核苷酸 片段中单个碱基的突变时,检出率高达90%;而400个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为80%。因而,在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于300个碱基,可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 、 PCR-SSCP技术的基本程序 PCR-SSCP技术的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产 物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取 决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部
②增加引物的长度；③调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓 度；④增加复性温度；⑤减少热循环次数。 （4）PCR 产物在凝胶电泳中成片状：①减少 Taq DNA 聚合酶的用量；②增 加复性温度，减少复性时间及延伸时间；③降低 Mg2+浓度；④减少循环次数； ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的 DNA，再次进行 PCR 反应。 3. 实验安全 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。 第二节 单链构象多态性（SSCP）分析 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析是 利用 DNA 或 RNA 单链构象具有多态性的特点，结合 PCR 进行基因检测的一种 分析技术，称为 PCR-SSCP 技术。其基本原理为：DNA 或 cDNA 在变性后，由 于序列的不同而导致单链 DNA 的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中，不同空间结构的单链 DNA 迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP 可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 PCR-SSCP 的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低，在检测 200 个核苷酸 片段中单个碱基的突变时，检出率高达 90%；而 400 个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为 80%。因而，在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于 300 个碱基，可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 一、PCR-SSCP 技术的基本程序 PCR-SSCP 技术的基本程序为：首先 PCR 扩增特定靶序列，然后将扩增产 物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时，DNA 单链的迁移率除与 DNA 链的长短有关外，更主要的是取 决于 DNA 单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA 单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由 DNA 单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部
顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚 至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后, 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插 入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常 DNA区分开。由此可见, PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术, 它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异 二、实验准备 (一)试剂 甲酰胺加样缓冲液(95%甲酰胺,20 mMOL/L EDTA,0.05%溴酚蓝和0.05% 甲苯青)、6%丙烯酰胺(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49:1)、10%甘油 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液(3%无水碳酸钠,0.2%甲醛,0.02%硫 代硫酸钠)、去离子水 (二)实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、髙速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪 、实验步骤 1.目的片段的PCR及其产物的变性根据扩增的目的片段制定PCR扩增 条件。PCR扩增结束后,用5倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于95℃ 变性5min并直接置于冰浴上。 2.电泳电泳胶有两种:①聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE组成。上样5μ,在室温下0.5W/cm,用0.5×BE电极缓冲液电泳25h 以上;②聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺和0.5×TBE组成。上样5μ,在4℃下 0.5Wcm,用0.5×TBE电极缓冲液电泳25h以上 3.染色取下凝胶,置10%醋酸固定液中30min,再以去离子水漂洗3次 (2min次),加入2%硝酸银染液染色20min后,去离子水洗胶20s,凝胶置显 影液中显色5~10min,以10%醋酸终止反应,漂洗及分析结果 4.结果判读SSCP结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同,仅存在 两条单链,因此在凝胶上多出现两条带,有时由于两条链接近可形成一条带,或
顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的 DNA 单链其顺序不同，甚 至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR 产物变性后， 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶 DNA 中含单碱基置换，或数个碱基插 入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异 DNA 与正常 DNA 区分开。由此可见，PCR-SSCP 分析技术是一种 DNA 单链凝胶电泳技术， 它根据形成不同构象的等长 DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异。 二、实验准备 （一）试剂 甲酰胺加样缓冲液（95%甲酰胺，20mmoL/L EDTA，0.05%溴酚蓝和 0.05% 二甲苯青）、6%丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49∶1）、10%甘油、 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液（3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫 代硫酸钠）、去离子水 （二）实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪。 三、实验步骤 1．目的片段的 PCR 及其产物的变性 根据扩增的目的片段制定 PCR 扩增 条件。PCR 扩增结束后，用 5 倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于 95℃ 变性 5min 并直接置于冰浴上。 2．电泳 电泳胶有两种：①聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在室温下 0.5W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上；②聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在 4℃下 0.5 W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上。 3．染色 取下凝胶，置 10%醋酸固定液中 30min，再以去离子水漂洗 3 次 （2min/次），加入 2%硝酸银染液染色 20min 后，去离子水洗胶 20s，凝胶置显 影液中显色 5～10min，以 10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。 4．结果判读 SSCP 结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同，仅存在 两条单链，因此在凝胶上多出现两条带，有时由于两条链接近可形成一条带，或
条单链有两种空间结构可形成三条带;突变个体由于等位基因不同,可以形成 四种不同的单链,因此在凝胶上多出现四条带,有时也可形成五条带。如果存在 复杂突变,可以形成超过5条的带纹(图2-3-1)。 图2-31SCP结果图(为未变性的PCR产物2、4、6、8、9为正常个体;3、5、 为突变携带者) 四、注意事项 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素:用于SSCP分析的核酸 片段越小,检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物可采用以下两种策 略进一步处理:①用限制性内切酶对PCR产物进行消化,产生较小片段;②通 过改变引物的位置和增加PCR扩增次数,缩短PCR产物 2.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素: 般情况下,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49:1。可以选用10%甘油在室 温或无甘油在4℃条件下进行电泳。 3.游离引物:游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引 物量为6nM都有明显影响。因此,应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引 物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR 产物。或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰 4.低浓度变性剂:凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%~10%甘油、5%尿 素或甲酸胺、10%二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提髙敏感性,可能是因为 轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。但 有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此,对同一序列使用2~3 种条件做SSCP,可能提高敏感性。 5.电泳温度:一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温 度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影 响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确
一条单链有两种空间结构可形成三条带；突变个体由于等位基因不同，可以形成 四种不同的单链，因此在凝胶上多出现四条带，有时也可形成五条带。如果存在 复杂突变，可以形成超过 5 条的带纹（图 2-3-1）。 图 2-3-1 SSCP 结果图（1 为未变性的 PCR 产物;2、4、6、8、9 为正常个体；3、5、7 为突变携带者） 四、注意事项 1. 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素： 用于 SSCP 分析的核酸 片段越小，检测的敏感性越高。对于大于 400bp 的 PCR 产物可采用以下两种策 略进一步处理：①用限制性内切酶对 PCR 产物进行消化，产生较小片段；②通 过改变引物的位置和增加 PCR 扩增次数，缩短 PCR 产物。 2. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素：一 般情况下，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为 49∶1。可以选用 10%甘油在室 温或无甘油在 4℃条件下进行电泳。 3. 游离引物：游离引物可能同 PCR 产物结合而改变其泳动率，即使游离引 物量为 6nM 都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引 物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化 PCR 产物。或者是稀释 PCR 产物，减少游离引物的干扰。 4. 低浓度变性剂：凝胶中加入低浓度的变性剂，如 5％～10％甘油、5％尿 素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为 轻微改变单链 DNA 的构象，增加分子的表面积，降低单链 DNA 的泳动率。但 有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用 2～3 种条件做 SSCP，可能提高敏感性。 5. 电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是 SSCP 分析最关键的因素，温 度有可能直接影响 DNA 分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影 响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确
保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气 冷却或循环水冷却等。 6.凝胶的长度:可用测序板进行SSCP分析,凝胶板长度在40cm以上。 7.凝胶浓度及厚度:凝胶浓度很重要,一般使用5%~8%的凝胶,凝胶浓 度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时, 最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对 SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝 胶越薄越好。 8.假阴性:一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果, 但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相 差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照, 结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是 否为突变带。由于PCR一SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过 设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未 知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。 9.结果分析:单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链 带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。如变性不彻底, 残留双链亦可形成一条带.因此,PCR一SSCP分析结果至少显示三条带。但是 由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足 为奇。 第三节基因表达谱研究技术 人类基因组大约有30000个左右的结构基因,其中在任一细胞中表达的基因 仅占总数的15%管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达,而 奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了 包括发育与分化、内环境稳定( homeostat)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰 老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心 机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段
保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气 冷却或循环水冷却等。 6. 凝胶的长度： 可用测序板进行 SSCP 分析，凝胶板长度在 40cm 以上。 7. 凝胶浓度及厚度： 凝胶浓度很重要，一般使用 5％～8％的凝胶，凝胶浓 度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的 SSCP 分析时， 最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对 SSCP 分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝 胶越薄越好。 8. 假阴性：一般认为，如没有污染，PCR－SSCP 分析不存在假阳性结果， 但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相 差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照， 结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是 否为突变带。由于 PCR－SSCP 的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过 设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未 知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。 9. 结果分析：单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链 带。PCR 产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底， 残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP 分析结果至少显示三条带。但是， 由于一种 DNA 单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足 为奇。 第三节 基因表达谱研究技术 人类基因组大约有 30000 个左右的结构基因，其中在任一细胞中表达的基因 仅占总数的 15%。管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达，而 奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了 包括发育与分化、内环境稳定(homeostans)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰 老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心 机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段
的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。因此,基因的表达谱研 究是揭示细胞生长、细胞分化、组织器官建立以及细胞衰老死亡的重要方向。 研究基因表达谱的方法主要有基因表达系列分析、基因芯片技术、差异显示 PCR法以及消减杂交技术等(表23-1) 表2-3-1不同基因表达谱研究技术的比较 技术与原理 优点 缺点 基因表达系列克隆、DNA测序不需特殊设备、实验成本克隆步骤较多、基因片段有可能丢失、提供 分析 较低、测序效率较高、可信息有限 获得新基因 基因芯片 分子杂交 操作简便、不需测序。实验费用高、需要特殊设备:存在假阳性和 假阴性:图象和数据分析工作量较大 差异显示PCR电泳、分子杂交、不需特殊设备、可展示所方法繁琐、假阳性高、片段短而靠近 PCR技术、DNA有基因、差异表达基因片mRNA3′末端。 测序 段、可获得新基因。 代表性差异分克隆、PCR技术、mRNA需求少、特异性高酶切连接步骤多、cDNA存在丢失现象、获 分子杂交 得的片段是酶切片段 抑制消减杂交PCR、克隆、测序特异性高 低丰度cDNA存在丢失、不能合成全长 技术 DNA 基于PCR的消分子杂交、PCR、设备要求不高、操作简研究经费高、不能同时展示所有的基因和差 减杂交技术克隆、测序 便、可获得新基因 异基因、存在一定的假阳性、需大量测序 、SAGE技术 (一)概述 基因表达系列分析( serial analysis of gene expression,SAGE)是由 Velculescu 等建立并用以分析基因组表达的方法,可以在未知目的基因的前提下,分析来自 一个细胞的全部转录本信息:;对已知或未知基因表达进行定性和定量分析;假阳 性率低,可重复性强 随着SAGE技术的日益成熟,在基因表达方面己经得到了广泛的使用。 (二)SAGE的原理 mRNA的3′末端特定部位存在可以标识其特异性的标签(tag),其长度 般在10~14个核苷酸之间,检测tag可以获得该mRNA的表达信息。SAGE技 术主要是基于以上原理,通过获得tag从而确定基因的表达情况。其次,分离获 得的tag可以通过串联连接克隆于载体上,以便测序,提高了分析效率。同时
的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。因此，基因的表达谱研 究是揭示细胞生长、细胞分化、组织器官建立以及细胞衰老死亡的重要方向。 研究基因表达谱的方法主要有基因表达系列分析、基因芯片技术、差异显示 PCR 法以及消减杂交技术等（表 2-3-1）。 表 2-3-1 不同基因表达谱研究技术的比较 方法 技术与原理 优点 缺点 基因表达系列 分析 克隆、DNA 测序 不需特殊设备、实验成本 较低、测序效率较高、可 获得新基因。 克隆步骤较多、基因片段有可能丢失、提供 信息有限。 基因芯片 分子杂交 操作简便、不需测序。 实验费用高、需要特殊设备；存在假阳性和 假阴性；图象和数据分析工作量较大。 差异显示 PCR 电泳、分子杂交、 PCR 技术、DNA 测序 不需特殊设备、可展示所 有基因、差异表达基因片 段、可获得新基因。 方 法 繁 琐 、 假 阳 性 高 、 片 段 短 而 靠 近 mRNA3＇末端。 代表性差异分 析技术 克隆、PCR 技术、 分子杂交 mRNA 需求少、特异性高 酶切连接步骤多、cDNA 存在丢失现象、获 得的片段是酶切片段。 抑制消减杂交 技术 PCR、克隆、测序 特异性高 低丰度 cDNA 存在丢失、不能合成全长 cDNA。 基于 PCR 的消 减杂交技术 分子杂交、PCR、 克隆、测序 设备要求不高、操作简 便、可获得新基因。 研究经费高、不能同时展示所有的基因和差 异基因、存在一定的假阳性、需大量测序。 一、SAGE 技术 （一）概述 基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）是由 Velculescu 等建立并用以分析基因组表达的方法，可以在未知目的基因的前提下，分析来自 一个细胞的全部转录本信息；对已知或未知基因表达进行定性和定量分析；假阳 性率低，可重复性强。 随着 SAGE 技术的日益成熟，在基因表达方面已经得到了广泛的使用。 （二）SAGE 的原理 mRNA 的 3＇末端特定部位存在可以标识其特异性的标签（tag），其长度一 般在 10～14 个核苷酸之间，检测 tag 可以获得该 mRNA 的表达信息。SAGE 技 术主要是基于以上原理，通过获得 tag 从而确定基因的表达情况。其次，分离获 得的 tag 可以通过串联连接克隆于载体上，以便测序，提高了分析效率。同时