第二篇细胞的遗传物质 第二章核酸杂交技术 自 Southern于1975年创建了检测特异DNA的核酸杂交技术以来, Southern 杂交以及在此基础上发展起来的其它核酸杂交技术已成为分子生物学的基本技 术 核酸杂交( hybrid ization)是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成 异质双链的过程。核酸杂交是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特 定条件下的变性和复性为手段的,对核酸分子进行定性和定量检测的技术。即把 经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定 的膜上,用已知特定序列的标记探针与之杂交,以检验该核酸片段是否与已知的 探针有同源序列。 核酸杂交既可以是DNA与DNA链、RNA与RNA链之间的杂交,又可以是 DNA与RNA链之间的杂交(图2-2-1)。待检核酸既可以是内源的又可以是外源 的,既可以是细胞生物的基因组又可以是质粒和病毒的核酸。探针或是用基因克 隆技术分离获得的特异的DNA序列,或是特异DNA序列在体外转录出的RNA 序列或cDNA序列,或是人工合成的寡核苷酸片段;探针的标记物或是放射性 同位素,或是一些非放射性物质如生物素、地高辛和荧光素等。核酸杂交可进行 染色体图谱分析,测定特异DNA序列的拷贝数(甚至可检测到哺乳动物基因组 中的单拷贝基因),鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记,进行基因克 隆的筛选,检测不同浓度的DNA,鉴别特异基因的表达部位,进行RNA结构的 初步分析、特异RNA的定量检测,分析基因转录的含量变化,末端标记的寡核 苷酸探针可检测点突变,确定有无病毒感染等。 图2-21核酸杂交路线图
第二篇 细胞的遗传物质 第二章 核酸杂交技术 自 Southern 于 1975 年创建了检测特异 DNA 的核酸杂交技术以来，Southern 杂交以及在此基础上发展起来的其它核酸杂交技术已成为分子生物学的基本技 术。 核酸杂交（hybridization）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成 异质双链的过程。核酸杂交是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特 定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。即把 经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定 的膜上，用已知特定序列的标记探针与之杂交，以检验该核酸片段是否与已知的 探针有同源序列。 核酸杂交既可以是 DNA 与 DNA 链、RNA 与 RNA 链之间的杂交，又可以是 DNA 与 RNA 链之间的杂交（图 2-2-1）。待检核酸既可以是内源的又可以是外源 的，既可以是细胞生物的基因组又可以是质粒和病毒的核酸。探针或是用基因克 隆技术分离获得的特异的 DNA 序列，或是特异 DNA 序列在体外转录出的 RNA 序列或 cDNA 序列，或是人工合成的寡核苷酸片段；探针的标记物或是放射性 同位素，或是一些非放射性物质如生物素、地高辛和荧光素等。核酸杂交可进行 染色体图谱分析，测定特异 DNA 序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组 中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克 隆的筛选，检测不同浓度的 DNA，鉴别特异基因的表达部位，进行 RNA 结构的 初步分析、特异 RNA 的定量检测，分析基因转录的含量变化，末端标记的寡核 苷酸探针可检测点突变，确定有无病毒感染等。 图 2-2-1 核酸杂交路线图
第一节核酸探针 、核酸探针的概念 核酸探针是含有标记物的已知特定序列的核酸片段,因为与待检测核酸片段 具有高度同源性而结合,可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具 、探针的种类及选择 根据核酸探针分子性质的不同可分为DNA探针和RNA探针,根据核酸探针 来源的不同又分为基因组DNA探针、人工合成的寡核苷酸探针和cDNA探针。 可以根据实验目的的不同和来源是否经济,选择不同性质或来源的探针。选择探 针时所应遵循的基本原则是核酸探针与待检测核酸片段间要具有髙度同源性。 、探针的标记 核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放 射性同位素标记的核酸探针具有灵敏度髙、特异性强等特点,但因放射性同位素 半衰期短、具放射性污染、成本高等原因,逐渐被非放射性的探针标记物-生物 素、地高辛和荧光素等替代。 (一)标记物的种类 1.放射性标记物放射性同位素是最早使用的核酸探针标记物。可供选择 的用于探针标记的放射性同位素有32P、H、3S、1C、13I、或BI,前三种较常 用。但放射性同位素在探针标记中由于存在放射性污染、半衰期短及在储存、运 输和后期处理上的不便利因素,而逐渐被安全性较高的非放射性标记物所替代 2.非放射性标记物 (1)生物素:生物素是一种生物小分子,可与亲和素( Avidin,Av)发生 特异性的结合,形成生物素亲和素的生物反应放大系统,而用于对标记有生物 素的核酸探针的显示。亲和素是一种碱性的糖蛋白,由四个相同的亚基组成,每 个亚基都可以结合一个生物素分子,这种四价反应产生了放大效应。生物素与亲 和素相互结合的亲和力高、稳定性很好。但亲和素是一种糖蛋白,应用中往往有 较髙的非特异性结合。1963年, Chaiet在从链球菌培养液中筛选抗菌素时发现 了一种能与生物素结合的类亲和素蛋白质-链酶亲和素( Streptavidin,,Sa)。链酶 亲和素与亲和素的结构相似,但不含糖基,因而以链酶亲和素代替亲和素,弥补
第一节 核酸探针 一、核酸探针的概念 核酸探针是含有标记物的已知特定序列的核酸片段，因为与待检测核酸片段 具有高度同源性而结合，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。 二、探针的种类及选择 根据核酸探针分子性质的不同可分为 DNA 探针和 RNA 探针，根据核酸探针 来源的不同又分为基因组 DNA 探针、人工合成的寡核苷酸探针和 cDNA 探针。 可以根据实验目的的不同和来源是否经济，选择不同性质或来源的探针。选择探 针时所应遵循的基本原则是核酸探针与待检测核酸片段间要具有高度同源性。 三、探针的标记 核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放 射性同位素标记的核酸探针具有灵敏度高、特异性强等特点，但因放射性同位素 半衰期短、具放射性污染、成本高等原因，逐渐被非放射性的探针标记物---生物 素、地高辛和荧光素等替代。 （一）标记物的种类 1．放射性标记物 放射性同位素是最早使用的核酸探针标记物。可供选择 的用于探针标记的放射性同位素有 32P、3H、35S、14C、125I、或 131I，前三种较常 用。但放射性同位素在探针标记中由于存在放射性污染、半衰期短及在储存、运 输和后期处理上的不便利因素，而逐渐被安全性较高的非放射性标记物所替代。 2．非放射性标记物 （1）生物素：生物素是一种生物小分子，可与亲和素（Avidin，Av）发生 特异性的结合，形成生物素-亲和素的生物反应放大系统，而用于对标记有生物 素的核酸探针的显示。亲和素是一种碱性的糖蛋白，由四个相同的亚基组成，每 个亚基都可以结合一个生物素分子，这种四价反应产生了放大效应。生物素与亲 和素相互结合的亲和力高、稳定性很好。但亲和素是一种糖蛋白，应用中往往有 较高的非特异性结合。1963 年，Chaiet 在从链球菌培养液中筛选抗菌素时发现 了一种能与生物素结合的类亲和素蛋白质-链酶亲和素（Streptavidin, Sa）。链酶 亲和素与亲和素的结构相似，但不含糖基，因而以链酶亲和素代替亲和素，弥补
了亲和素非特异性结合高的缺点 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性,通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物酶 ( horseradish peroxidase)相互作用,形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 (或荧光素)”连接复合体。之后,通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是,由于生物素普遍存在于 生物体内,因此在 Souther、 Northern和原位杂交中造成本底升高。另外,生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上,也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点,促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物, (2)地高辛:地高辛( digoxigenin,Dig)是一种类固醇半抗原分子,可以通过 连接臂被人工连接于dUTP上,如形成Dg- 11-dUTP,在酶学反应中可代替 dTTP掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛,所以相对来说, 以地高辛标记的探针在 Southern、 Northern和原位杂交中本底较低,它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体,可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测,如使报道酶发生水解生色或化学发光反 (3)荧光素:核酸探针可以直接用荧光素( fluorecein)标记,如罗丹明或FITC。 荧光素标记的探针系统,使用的是荧光素-12-dUTP或荧光素-12-UTP(也有用荧 光素-ll-dUTP或荧光素-11UTP)代替dTPP或TP在酶学反应中掺入到探针中 去,然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物 酶( horserad ish peroxidase)的抗荧光素抗体检测。 (二)探针标记的方法 总体看来,核酸探针标记的方法有两大类:酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上,常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物一连接有硝基苯叠氮的生物素一光敏生物素在UV 或强可见光(350nm)照射激发下,形成的一个芳香硝基中间化合物(氮宾)可 以非特异性地与DNA或RNA形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中,这样,标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质
了亲和素非特异性结合高的缺点。 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性，通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase）相互作用，形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 （或荧光素）”连接复合体。之后，通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是，由于生物素普遍存在于 生物体内，因此在 Southern、Northern 和原位杂交中造成本底升高。另外，生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上，也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点，促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物。 （2）地高辛：地高辛(digoxigenin, Dig)是一种类固醇半抗原分子，可以通过 一连接臂被人工连接于 dUTP 上，如形成 Dig-11-dUTP，在酶学反应中可代替 dTTP 掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛，所以相对来说， 以地高辛标记的探针在 Southern、Northern 和原位杂交中本底较低，它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体，可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测，如使报道酶发生水解生色或化学发光反 应。 （3）荧光素：核酸探针可以直接用荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或 FITC。 荧光素标记的探针系统，使用的是荧光素-12-dUTP 或荧光素-12-UTP（也有用荧 光素-11-dUTP 或荧光素-11-UTP）代替 dTTP 或 TTP 在酶学反应中掺入到探针中 去，然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase）的抗荧光素抗体检测。 （二）探针标记的方法 总体看来，核酸探针标记的方法有两大类：酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上，常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR 末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物—连接有硝基苯叠氮的生物素—光敏生物素在 UV 或强可见光（350nm）照射激发下，形成的一个芳香硝基中间化合物（氮宾）可 以非特异性地与 DNA 或 RNA 形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中，这样，标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质
所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每200个左右核苷酸才带有 个生物素残基,所以不会影响探针与靶核酸的杂交,足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern杂交中检测出单拷贝序列。相比之下,光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法,另外,光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多,所以,在进行探针标记时,人们首选的是酶学标记法 四、探针的纯化 般情况下,用于杂交的核酸探针在制备完成后,可直接用于进行杂交实验 但如果探针过长的话(>25nt),在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成,对于某些探针精度要求较高的实验,需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern杂交技术 Southern杂交的概念 Southern杂交技术是将凝胶电泳分离的酶切DNA片段通过印记法 ( Imprinting)转移到硝酸纤维素膜上,检测标记过的探针是否与变性后的DNA 发生杂交,而对靶DNA进行定性和定量的一项分子生物学技术,包括DNA的 印记转移和DNA的杂交两部分内容。 、 Southern杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组DNA,并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组DNA,消化后所得的DNA片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离,再对DNA进行原位变性,以印记法将DNA片段从胶上转移至固相支持物 上(如尼龙膜或硝酸纤维素膜)(图2-2-2),用标记的DNA或RNA探针在膜上 与转印后的DNA片段杂交,最后,针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶DNA 的存在及位置(图2-2-3)。 图2-2-2印记转移 图2-2-3 Southern杂交路线图
所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每 200 个左右核苷酸才带有一 个生物素残基，所以不会影响探针与靶核酸的杂交，足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern 杂交中检测出单拷贝序列。相比之下，光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法，另外，光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多，所以，在进行探针标记时，人们首选的是酶学标记法。 四、探针的纯化 一般情况下，用于杂交的核酸探针在制备完成后，可直接用于进行杂交实验。 但如果探针过长的话（＞25nt），在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成，对于某些探针精度要求较高的实验，需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern 杂交技术 一、Southern 杂交的概念 Southern 杂交 技术 是将 凝胶 电泳 分离 的酶 切 DNA 片段通 过印 记法 （imprinting）转移到硝酸纤维素膜上，检测标记过的探针是否与变性后的 DNA 发生杂交，而对靶 DNA 进行定性和定量的一项分子生物学技术，包括 DNA 的 印记转移和 DNA 的杂交两部分内容。 二、Southern 杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组 DNA，并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组 DNA，消化后所得的 DNA 片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离，再对 DNA 进行原位变性，以印记法将 DNA 片段从胶上转移至固相支持物 上（如尼龙膜或硝酸纤维素膜）（图 2-2-2），用标记的 DNA 或 RNA 探针在膜上 与转印后的 DNA 片段杂交，最后，针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶 DNA 的存在及位置（图 2-2-3）。 图 2-2-2 印记转移 图 2-2-3 Southern 杂交路线图
三、 Southern杂交的实验步骤 (一)材料与设备 1. PBS: 0.137 mol/L NaCI 2.68 mmol/L KCl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4(pH7.2) 2.STEL缓冲液:0.2%SDS 10 mmol/L Tris-HCI (pH7.5) 10 mmol/L EDta 100 mmol/L LiCl 3. 5 mol/L LiCI T缓冲液:10 mmol/L Tris-HCI(80) I mmolL EDTA(8.0) 5.限制酶高盐缓冲液(1×):100 mmol/L NaCl 50 mmol/L Tris-HCI(7.5) O mmolL MgCl 1 mmol/L DTT 6.限制酶中盐缓冲液(1×):50 mmol/L NaCI 10 mmol/L Tris-HCI (7.5) 10 mmol/L MgClz I mmol/L Dtt 限制酶低盐缓冲液(1×):10mmo/ L Tris-HCI(75) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L dtt 8.牛血清白蛋白:1 mg/ml 9.限制性内切酶 10.上样液(6×):0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF
三、Southern 杂交的实验步骤： （一）材料与设备 1．PBS：0.137 mol/L NaCl 2.68 mmol/L KCl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4 (pH 7.2) 2．STEL 缓冲液：0.2% SDS 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5) 10 mmol/L EDTA 100 mmol/L LiCl 3．5 mol/L LiCl 4．TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (8.0) 1 mmol/L EDTA (8.0) 5．限制酶高盐缓冲液（1×）：100 mmol/L NaCl 50 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 6．限制酶中盐缓冲液（1×）：50 mmol/L NaCl 10 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 7．限制酶低盐缓冲液（1×）：10 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT 8．牛血清白蛋白：1 mg/ml 9．限制性内切酶 10．上样液（6×）：0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯氰 FF
30%甘油水溶液 0×TBE:Tis545g 硼酸278g EDTA 46.5g 去离子水5L 12.亚精胺:100 mmol/L 13.溴化乙锭(EB):10mg/ml的母液 脱嘌呤缓冲液:0.25molL 5.变性缓冲液:1.5 mol/ Nacl 0.5 mol/ naoh 16.转移缓冲液:1.5 mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH 17. 20xSCC: 3 mol/L NaCI 03moL柠檬酸钠 调节pH为7.0 18.100× Denhardt氏溶液:2%(w/)BSA 2%(w/)聚蔗糖 2%(w)聚乙烯吡咯烷酮 贮存于20℃。 19.10%SDS 0.预杂交液:6×SSC 5 dEnhardt溶液 0.5%(m/)SDs lug/ml Poly (A) l00μg/ml鲑鱼精子DNA 50%(v)甲酰胺 21.标记探针 22.洗膜液A:2xSSC 0.5% SDS
30%甘油水溶液 11．10×TBE：Tris 545g 硼酸 278g EDTA 46.5g 去离子水 5L 12．亚精胺：100 mmol/L 13．溴化乙锭（EB）：10 mg/ml 的母液 14．脱嘌呤缓冲液：0.25 mol/L HCl 15．变性缓冲液：1.5 mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH 16．转移缓冲液：1.5 mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH 17．20×SCC：3 mol/L NaCl 0.3 mol/L 柠檬酸钠 调节 pH 为 7.0 18．100×Denhardt 氏溶液：2%（w/v）BSA 2%（w/v）聚蔗糖 2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮 贮存于-20℃。 19．10%SDS 20．预杂交液：6×SSC 5×Denhardt 溶液 0.5%（m/v）SDS 1μg/ml Poly（A） 100μg/ml 鲑鱼精子 DNA 50%（v/v）甲酰胺 21．标记探针 22．洗膜液 A：2×SSC 0.5% SDS
23.洗膜液B:2xSSC 24.洗膜液C:0.1×SSC 0.1% SDS 25.酚:氯仿(1:1w) 26.杂交液:在预杂交液中加入10%(w)硫酸葡聚糖。 27.抗地高辛溶液:2.5μ抗地高辛抗体碱性磷酸酶结合物 I mol/L Tris-HCl(pH9.5) 5 mol/L NaCI 28.检测缓冲液:0.1moL二乙醇胺 I mmol/L Mecl 0.02%叠氮化钠 用浓HCl调节pH到100。 29. AMPPD溶液:在3u检测缓冲液中加入6 Hl Tropix AMPPD。 30.脱色液:0.1×SSC 0.1% SDS 31.有关设备:电热板、电泳仪、电泳槽、长波紫外灯(365nm)、312nm 紫外灯、尼龙杂交膜、杂交袋或杂交瓶 (二)样本制备 DNA提取具体步骤见细胞内核酸的提取 2.DNA的限制性内切酶消化DNA的限制性内切酶是从细菌中分离出来 的、在特定序列识别并切割双链DNA的蛋白酶,包括Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。分子 生物学中常用的是Ⅱ类DNA限制性内切酶,识别并切割双链DNA的特定序列 通常是4~6个核苷酸长度的短的回文结构,如 AAGCTT(HindⅢ)、 GAATTC ( ECoRI)、 GAGCTC(SacI)等,不同的酶切割的结果有所不同:有些酶在 回文结构的对称点上同时切割DNA双链而产生平末端的DNA片段;另外一些 酶则在回文结构对称点左右相应的位点同时切割两条链而形成粘末端的DNA片 段。DNA的限制性内切酶的消化步骤如下
23．洗膜液 B：2×SSC 0.1% SDS 24．洗膜液 C：0.1×SSC 0.1% SDS 25．酚:氯仿（1:1 v/v） 26．杂交液：在预杂交液中加入 10%（w/v）硫酸葡聚糖。 27．抗地高辛溶液：2.5μl 抗地高辛抗体/碱性磷酸酶结合物 1 mol/L Tris-HCl（pH9.5） 1 mol/L MgCl2 5 mol/L NaCl 28．检测缓冲液：0.1 mol/L 二乙醇胺 1 mmol/L MgCl2 0.02%叠氮化钠 用浓 HCl 调节 pH 到 10.0。 29．AMPPD 溶液：在 3μl 检测缓冲液中加入 6μl Tropix AMPPD。 30．脱色液：0.1 ×SSC 0.1% SDS 31．有关设备：电热板、电泳仪、电泳槽、长波紫外灯（365nm）、312nm 紫外灯、尼龙杂交膜、杂交袋或杂交瓶 （二）样本制备 1．DNA 提取 具体步骤见细胞内核酸的提取 2．DNA 的限制性内切酶消化 DNA 的限制性内切酶是从细菌中分离出来 的、在特定序列识别并切割双链 DNA 的蛋白酶，包括Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。分子 生物学中常用的是Ⅱ类 DNA 限制性内切酶，识别并切割双链 DNA 的特定序列 通常是 4～6 个核苷酸长度的短的回文结构，如 AAGCTT（Hind Ⅲ）、GAATTC （Eco RⅠ）、GAGCTC（Sac Ⅰ）等，不同的酶切割的结果有所不同：有些酶在 回文结构的对称点上同时切割 DNA 双链而产生平末端的 DNA 片段；另外一些 酶则在回文结构对称点左右相应的位点同时切割两条链而形成粘末端的 DNA 片 段。DNA 的限制性内切酶的消化步骤如下
(1)在冰水浴中混合下列反应成分于微量离心管中,组成DNA限制性内 切酶酶切反应体系混合液: 酶切缓冲液 lmg/ml的牛血清白蛋白 待切割的DNA 加灭菌蒸馏水至终体积为50μul,混匀,于4℃放置Ih,以确保DNA均匀分 (2)取出冷冻的限制性内切酶,待溶化后,用灭菌微量吸管迅速吸取5单 位酶加入反应管中,在冰水浴中温和搅拌2min,再升至酶切反应所需的温度(大 多数酶的反应温度为37℃,但有些酶的反应温度偏高或偏低,所以应以酶的产 品说明书提供的温度为准),保温Ih(如果是基因组DNA,保温8~12h)。 (3)如果使用的限制性内切酶不只一种,消化20min后,加入第二份限制 酶(5单位/gDNA),重复步骤② (4)取2山反应后的酶切样品,加上样液后电泳检查酶切是否完全。 3.琼脂糖凝胶电泳选择不同浓度(0.2%~3%)的琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳结束后于紫外灯下检测。 4.琼脂糖凝胶电泳的印记转移探针与目的DNA片段的杂交所依附的支 持物可以是液相的也可以是固相的,常用的是固相支持物。在将电泳分离后的 DNA片段转印到固相支持物上之前,要对琼脂糖凝胶上的DNA片段进行适当处 理,首先,将电泳后的DNA片段在紫外灯下与 marker进行对比,看目的DNA 片段是否较长(>15kb),大片段的DNA转移较慢且效率较低,可以用弱酸进 行脱嘌呤处理,以水解DNA成较小片段来增加转卬效率,通常脱嘌呤处理应在 弱酸环境下作用到溴酚蓝变成黄色或二甲苯青变成黄绿色,水解后的DNA片段 长度以为原来长度的三分之一左右为宜,过短的DNA片段在印记转移过程中容 易丢失和扩散,扩散将使检测观察到的DNA条带模糊。其次,要对双链DNA 进行变性处理。这些处理工作完成后将琼脂糖凝胶上的DNA片段以适当的方法 转移到固相支持物上以备杂交 将电泳分离后的DNA片段转移到固相支持物是印记杂交的关键步骤,目前, 常用的转移方法有五种:液流向上的毛细管转移法、液流向下的毛细管转移法
（1）在冰水浴中混合下列反应成分于微量离心管中，组成 DNA 限制性内 切酶酶切反应体系混合液： 酶切缓冲液 5μl 1 mg/ml 的牛血清白蛋白 5μl 待切割的 DNA 1μg 加灭菌蒸馏水至终体积为 50μl，混匀，于 4℃放置 1h，以确保 DNA 均匀分 散。 （2）取出冷冻的限制性内切酶，待溶化后，用灭菌微量吸管迅速吸取 5 单 位酶加入反应管中，在冰水浴中温和搅拌 2min，再升至酶切反应所需的温度（大 多数酶的反应温度为 37℃，但有些酶的反应温度偏高或偏低，所以应以酶的产 品说明书提供的温度为准），保温 1h（如果是基因组 DNA，保温 8～12h）。 （3）如果使用的限制性内切酶不只一种，消化 20min 后，加入第二份限制 酶（5 单位/μg DNA），重复步骤②。 （4）取 2μl 反应后的酶切样品，加上样液后电泳检查酶切是否完全。 3．琼脂糖凝胶电泳 选择不同浓度（0.2%～3%）的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳结束后于紫外灯下检测。 4．琼脂糖凝胶电泳的印记转移 探针与目的 DNA 片段的杂交所依附的支 持物可以是液相的也可以是固相的，常用的是固相支持物。在将电泳分离后的 DNA 片段转印到固相支持物上之前，要对琼脂糖凝胶上的 DNA 片段进行适当处 理，首先，将电泳后的 DNA 片段在紫外灯下与 marker 进行对比，看目的 DNA 片段是否较长（＞15kb），大片段的 DNA 转移较慢且效率较低，可以用弱酸进 行脱嘌呤处理，以水解 DNA 成较小片段来增加转印效率，通常脱嘌呤处理应在 弱酸环境下作用到溴酚蓝变成黄色或二甲苯青变成黄绿色，水解后的 DNA 片段 长度以为原来长度的三分之一左右为宜，过短的 DNA 片段在印记转移过程中容 易丢失和扩散，扩散将使检测观察到的 DNA 条带模糊。其次，要对双链 DNA 进行变性处理。这些处理工作完成后将琼脂糖凝胶上的 DNA 片段以适当的方法 转移到固相支持物上以备杂交。 将电泳分离后的 DNA 片段转移到固相支持物是印记杂交的关键步骤，目前， 常用的转移方法有五种：液流向上的毛细管转移法、液流向下的毛细管转移法
上下同时向两张膜转移法、电转移法和真空转移法。 最初所选用的固相支持物是硝酸纤维素膜,核酸通过疏水相互作用与硝酸纤 维素膜结合,牢固程度较差,在碱性条件下的结合能力进一步下降,且这种膜质 地较脆,操作时需格外小心。目前核酸杂交实验多采用尼龙膜,尼龙膜坚固耐用, 可进行多次杂交;而且核酸可在低离子强度下结合到尼龙膜上,可用电转移法将 DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶上转移到尼龙膜上,极大提髙了转移效率,在紫外 线照射下,核酸可与尼龙膜发生共价结合而被固定。另外,带电荷的尼龙膜结合 核酸的能力更强,且带正电荷的尼龙膜在碱性转移缓冲液中可与核酸共价结合, 转移后不需进行固定。 以毛细管转移法介绍印记转移的操作过程:①将修整后的凝胶浸泡于脱嘌呤 缓冲液中直至溴酚蓝变为黄色;②弃掉脱嘌呤缓冲液,用去离子水冲洗凝胶数次; ③将胶浸入变性缓冲液,室温轻摇40min:④弃掉变性缓冲液,用去离子水冲洗 凝胶一次;⑤将胶放置在毛细管转移装置上,DNA片段转移需16小时;⑥将胶 从转移装置上取下,在杂交膜上对应于点样孔位置作适当记号;⑦用2×SSC缓 冲液淋洗杂交膜数秒:⑧将杂交膜放入烘箱,80℃烘烤5omi;⑨将杂交膜不含 DNA的一面朝向312nm紫外灯照射3min以固定DNA。 (三)探针 任选探针制备中所提供的方法制备放射性标记的或非放射性标记的探针。 (四)杂交 杂交的目的是以带有标记物的探针去对目的核酸进行定性、定位检测,而探 针与目的核酸的准确复性是影响杂交实验的关键所在,所以,杂交环境及用于进 行杂交的探针的特异性和纯度对于确保杂交实验的成功就显得尤为重要。 杂交步骤包括:①于杂交管中用6×SSC洗膜,之后加入10m预杂交液,65℃ 摇动4h;②探针于沸水中变性5min,变性后的探针与10ml(65℃)混合;③弃 去预杂交液,加入含有探针的杂交液,42℃摇动过夜;④杂交结束后,将膜取出, 放入含有数百毫升洗膜液A的器皿中,轻轻震荡洗膜5min,此时勿使膜干燥 ⑤如果探针是被放射性物质标记的,应将洗膜后的废液倒λ处理放射性污染的废 液缸中;⑥向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液B,轻轻震荡洗膜15mi,洗 后弃去洗膜液;⑦向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液C,65℃轻轻震荡2h
上下同时向两张膜转移法、电转移法和真空转移法。 最初所选用的固相支持物是硝酸纤维素膜，核酸通过疏水相互作用与硝酸纤 维素膜结合，牢固程度较差，在碱性条件下的结合能力进一步下降，且这种膜质 地较脆，操作时需格外小心。目前核酸杂交实验多采用尼龙膜，尼龙膜坚固耐用， 可进行多次杂交；而且核酸可在低离子强度下结合到尼龙膜上，可用电转移法将 DNA 片段从聚丙烯酰胺凝胶上转移到尼龙膜上，极大提高了转移效率，在紫外 线照射下，核酸可与尼龙膜发生共价结合而被固定。另外，带电荷的尼龙膜结合 核酸的能力更强，且带正电荷的尼龙膜在碱性转移缓冲液中可与核酸共价结合， 转移后不需进行固定。。 以毛细管转移法介绍印记转移的操作过程：①将修整后的凝胶浸泡于脱嘌呤 缓冲液中直至溴酚蓝变为黄色；②弃掉脱嘌呤缓冲液，用去离子水冲洗凝胶数次； ③将胶浸入变性缓冲液，室温轻摇 40min；④弃掉变性缓冲液，用去离子水冲洗 凝胶一次；⑤将胶放置在毛细管转移装置上，DNA 片段转移需 16 小时；⑥将胶 从转移装置上取下，在杂交膜上对应于点样孔位置作适当记号；⑦用 2×SSC 缓 冲液淋洗杂交膜数秒；⑧将杂交膜放入烘箱，80℃烘烤 50min；⑨将杂交膜不含 DNA 的一面朝向 312nm 紫外灯照射 3min 以固定 DNA。 （三）探针 任选探针制备中所提供的方法制备放射性标记的或非放射性标记的探针。 （四）杂交 杂交的目的是以带有标记物的探针去对目的核酸进行定性、定位检测，而探 针与目的核酸的准确复性是影响杂交实验的关键所在，所以，杂交环境及用于进 行杂交的探针的特异性和纯度对于确保杂交实验的成功就显得尤为重要。 杂交步骤包括：①于杂交管中用 6×SSC 洗膜，之后加入 10ml 预杂交液，65℃ 摇动 4h；②探针于沸水中变性 5min，变性后的探针与 10ml（65℃）混合；③弃 去预杂交液，加入含有探针的杂交液，42℃摇动过夜；④杂交结束后，将膜取出， 放入含有数百毫升洗膜液 A 的器皿中，轻轻震荡洗膜 5min，此时勿使膜干燥！ ⑤如果探针是被放射性物质标记的，应将洗膜后的废液倒入处理放射性污染的废 液缸中；⑥向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液 B，轻轻震荡洗膜 15min，洗 后弃去洗膜液；⑦向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液 C，65℃轻轻震荡 2h；
⑧将膜取出,用聚乙烯膜(或袋)包好,勿使膜干燥;⑨如使用的是放射性探针, 应立即进行放射自显影;⑩放射自显影结束后,洗去第一个探针后,还可与第二 个探针杂交。 (五)杂交后标记探针的检测 对于带有不同标记的探针,可以有不同的检测方法。如果使用的是放射性探 针,则采用放射自显影使ⅹ光胶片曝光而加以显示;如采用的是非放射性物质 (生物素或地髙辛)标记的探针,则是先以偶联有报道酶(常用碱性磷酸酶或辣 根过氧化物酶)的可与非放射性标记物特异结合的配基(链亲和素或抗地高辛抗 体)与对应的非放射性标记物(生物素或地高辛)发生特异结合,然后或是利用 某些物质可与报道酶发生颜色反应而间接地对靶核酸加以显示,或是利用某些物 质可与报道酶发生化学发光反应而得以对目的核酸加以检测。 显色反应中常用的报道酶是碱性磷酸酶。化学发光反应中使用的报道酶既可 以是辣根过氧化物酶(HRP)又可以是碱性磷酸酶。 放射性同位素标记探针的检测步骤这些步骤包括:①用放射性标记的 探针与膜杂交,杂交完成后,洗膜,用吸水纸吸去大部分膜上的水;②将潮湿的 膜用 Saran膜包好,放在增感屏内,于一70℃用ⅹ-光胶片曝光24h(检测哺乳动 物基因组中的单拷贝序列曝光2h左右)。 2.非放射性标记探针的化学发光法检测步骤报道酶既可以是碱性磷酸酶 也可以是辣根过氧化物酶。如果是辣根过氧化物酶(HRP),则应用HRP鲁米诺 检测系统:如果应用碱性磷酸酶,则应用碱性磷酸酶- AMPPD检测系统。以下介 绍一个以地高辛作为非放射性标记物,报道酶为碱性磷酸酶,发光底物为AMPD 的检测系统的操作步骤:①用含有地高辛标记的探针与杂交膜预杂交、杂交和洗 膜;②将与地髙辛标记的探针杂交后的杂交膜浸入含有200m抗地髙辛溶液的容 器中,室温,30min;③将膜浸泡于检测缓冲液中,室温,10min;④将膜放置 于一块与X-光胶片盒大小一致的有机玻璃板上,并放在Ⅹ光胶片盒上:⑤小 地向膜上加 AMPPD溶液,之后用 Saran膜包好以防干燥;⑥曝光于37℃ (或室温过夜);⑦用脱色液洗涤10min;⑧用TE冲洗,空气干燥后贮存, 四、注意事项 Southern杂交的注意事项包括以下几个方面
⑧将膜取出，用聚乙烯膜（或袋）包好，勿使膜干燥；⑨如使用的是放射性探针， 应立即进行放射自显影；⑩放射自显影结束后，洗去第一个探针后，还可与第二 个探针杂交。 （五）杂交后标记探针的检测 对于带有不同标记的探针，可以有不同的检测方法。如果使用的是放射性探 针，则采用放射自显影使 X 光胶片曝光而加以显示；如采用的是非放射性物质 （生物素或地高辛）标记的探针，则是先以偶联有报道酶（常用碱性磷酸酶或辣 根过氧化物酶）的可与非放射性标记物特异结合的配基（链亲和素或抗地高辛抗 体）与对应的非放射性标记物（生物素或地高辛）发生特异结合，然后或是利用 某些物质可与报道酶发生颜色反应而间接地对靶核酸加以显示，或是利用某些物 质可与报道酶发生化学发光反应而得以对目的核酸加以检测。 显色反应中常用的报道酶是碱性磷酸酶。化学发光反应中使用的报道酶既可 以是辣根过氧化物酶（HRP）又可以是碱性磷酸酶。 1．放射性同位素标记探针的检测步骤 这些步骤包括：①用放射性标记的 探针与膜杂交，杂交完成后，洗膜，用吸水纸吸去大部分膜上的水；②将潮湿的 膜用 Saran 膜包好，放在增感屏内，于－70℃用 X-光胶片曝光 24h（检测哺乳动 物基因组中的单拷贝序列曝光 2h 左右）。 2．非放射性标记探针的化学发光法检测步骤 报道酶既可以是碱性磷酸酶 也可以是辣根过氧化物酶。如果是辣根过氧化物酶（HRP），则应用 HRP-鲁米诺 检测系统；如果应用碱性磷酸酶，则应用碱性磷酸酶-AMPPD 检测系统。以下介 绍一个以地高辛作为非放射性标记物，报道酶为碱性磷酸酶，发光底物为AMPPD 的检测系统的操作步骤：①用含有地高辛标记的探针与杂交膜预杂交、杂交和洗 膜；②将与地高辛标记的探针杂交后的杂交膜浸入含有 200ml 抗地高辛溶液的容 器中，室温，30min；③将膜浸泡于检测缓冲液中，室温，10min；④将膜放置 于一块与 X-光胶片盒大小一致的有机玻璃板上，并放在 X-光胶片盒上；⑤小心 地向膜上加 AMPPD 溶液，之后用 Saran 膜包好以防干燥；⑥曝光于 37℃，3h （或室温过夜）；⑦用脱色液洗涤 10min；⑧用 TE 冲洗，空气干燥后贮存。 四、注意事项 Southern 杂交的注意事项包括以下几个方面
