第二篇细胞的遗传物质 第一章细胞内核酸的提取 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入,标志着现代医 学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包 括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。 核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础,是重要的生物信息分子,也是 分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动,如种族遗传、生长等有密 切联系;它与生命的异常活动,如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药 物的作用机理等也有密切的关系。因此,核酸是现代生命科学体系中重点研究 的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验 技术中基本的操作之 第一节真核细胞基因组DNA的分离与纯化 DNA主要在细胞核内,核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真 核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多,并且以核蛋白体形式存 在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤 裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是去除体系中的其它 成分,如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸(RNA)等生物大分子的 过程 裂解 细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切 片等方法。为了获得大量完整的DNA,一般采用裂解液等温和的方法破碎细 胞 裂解液一般都含有去污剂(如SDS、 Triton X-100、NP-40、 Tween20等) 和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性,破坏 膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的 作用,一方面提供一个合适的裂解环境(如Tri),另一方面可抑制核酸酶在
1 第二篇 细胞的遗传物质 第一章 细胞内核酸的提取 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医 学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包 括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。 核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是 分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密 切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药 物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究 的课题之一。核酸分为 DNA 和 RNA 两大类。核酸的提取是分子生物学实验 技术中基本的操作之一， 第一节 真核细胞基因组 DNA 的分离与纯化 DNA 主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体 DNA 等。真 核细胞的 DNA 分子比原核生物的 DNA 分子大得多，并且以核蛋白体形式存 在于细胞中。真核细胞基因组 DNA 提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。 裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它 成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的 过程。 一、裂解 细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切 片等方法。为了获得大量完整的 DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细 胞。 裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏 膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的 作用，一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在
裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCI)。裂 解体系中还可以加入蛋白酶:利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸 与蛋白质的分开,便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸 、纯化 根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA提取的实验步骤 (一)材料与设备 试剂消化液(100 mmolL NaCl 10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,25mmol/L EDIA,0.5%SDS,0.1mg/ml蛋白酶K);pH8.0,25 mMo/L EDtA;PBS; TES饱和酚:氯仿:异戊醇;95%乙醇溶液;70%乙醇溶液;TE;0.1%SDS; lpg/ mI rNa酶; 2仪器培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管;刻度吸管;加样器;枪头: 离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱 (二)主要步骤 1如果材料为组织块,可将组织块(约200-1000mg)剪碎后,置入液氮 中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎,每100mg组织加入1,2m消化液 (100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 25mmoI/L EDTA,0. 5%SDS 0.lmg/m蛋白酶K)。 2如果材料是悬浮细胞,收集细胞于微量离心管中,500g×5min离心;如 果材料是贴壁细胞,弃上清后,胰酶消化收集细胞,500g×5min离心。随后用 冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞,500g×5min离心,弃上清,重复一次,并用 倍体积的消化液重悬细胞 3组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中,50℃消化12~18h。 4冷却至4℃,加等体积15mol/LTES饱和酚。 5轻轻振摇,使水相和酚层充分混匀。 6.4℃5000pm~8000rpm离心15min~20min。此时DNA溶液在上层,酚 位于下层,中间是变性蛋白层。 7用吸管小心吸取上层粘稠溶液,移至另一离心管。注意尽量不要带出中 间蛋白层
2 裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂 解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸 与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。 二、纯化 根据 DNA 本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA 提取的实验步骤 （一）材料与设备 1.试剂 消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml 蛋白酶 K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS； TES 饱和酚；氯仿；异戊醇； 95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS； 1μg/ml RNA 酶； 2.仪器 培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头； 离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱 （二）主要步骤 1.如果材料为组织块，可将组织块（约 200~1000mg）剪碎后，置入液氮 中。随后用冰冷的组 织捣碎器捣碎， 每 100mg 组织加入 1.2ml 消化液 （100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS， 0.1mg/ml 蛋白酶 K）。 2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min 离心；如 果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min 离心。随后用 冰冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞，500g×5min 离心，弃上清，重复一次，并用一 倍体积的消化液重悬细胞。 3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化 12～18h。 4.冷却至 4℃，加等体积 15 mo1／L TES 饱和酚。 5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。 6. 4℃5000rpm～8000rpm 离心 15min～20min。此时 DNA 溶液在上层，酚 位于下层，中间是变性蛋白层。 7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中 间蛋白层
8.DNA溶液再加等体积15mol/LTES饱和酚抽提一次,按6、7离心 并吸至另一离心管。 9加等体积氯仿/异戊醇按步骤(5、6)抽提,离心5min 10吸出DNA溶液后,再步骤(9)抽提一次。 1l)用吸管将DNA溶液移至 Eppendorf中,冰浴至0℃ 12加2.5倍体积95%冷乙醇震摇,可见DNA白色沉淀析出 13用75%冷乙醇清洗3~4次 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15加适量TE溶液溶解DNA。 四、结果鉴定 1.紫外分光光度计检测:可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在 260nm时吸光度最大,而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2u1DNA溶解液, 适量稀释,紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值,计算OD260/OD280 比值,比值在1.7-~2.0:1之间,说明DNA纯度可。在260nm处,1OD双链DNA 的浓度为5oμg/ml,据此可计算DNA的浓度(g/ml)=50×(OD260)×稀 释倍数。 2.电泳检测:可检测核酸的完整性和大小。取2μlDNA溶解液与适量上 样缓冲液混合后,经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察,拍照; 如果观察到一条清晰的电泳带,无明显的拖尾,说明DNA完整性好。 第二节真核细胞总RNA的分离提取 RNA是基因表达产物,由以下几类分子组成,TRNA(占细胞总RNA的 80%~85%)、tRNA和核内小分子RNA(占10~15%)、mRNA(占1~5%) 其中mRNA是分子生物学的主要研究对象,分离制备mRNA是克隆基因,分 析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤 真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的 RNA分子,包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶 的污染。RNA酶活性非常稳定,分布广泛,除细胞内源性的RNA酶外,环境 中也存在RNA酶。因此在提取RNA时,应尽量创造一个无RNA酶的环境
3 8. DNA 溶液再加等体积 15 mo1／L TES 饱和酚抽提一次，按 6、7 离心 并吸至另一离心管。 9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心 5min。 10.吸出 DNA 溶液后，再步骤（9）抽提一次。 11.用吸管将 DNA 溶液移至 Eppendorf 中，冰浴至 0℃。 12.加 2.5 倍体积 95%冷乙醇震摇，可见 DNA 白色沉淀析出。 13.用 75%冷乙醇清洗 3～4 次。 14.室温干燥或冷冻干燥 DNA。 15.加适量 TE 溶液溶解 DNA。 四、结果鉴定 1．紫外分光光度计检测：可检测 DNA 的纯度和含量。一般而言核酸在 260nm 时吸光度最大，而蛋白质在 280nm 时吸光度最大。取 2μl DNA 溶解液， 适量稀释，紫外分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，比值在 1.72.0:1 之间，说明 DNA 纯度可。在 260nm 处，1OD 双链 DNA 的浓度为 50g /ml，据此可计算 DNA 的浓度（g /ml）=50×(OD260) × 稀 释倍数。 2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取 2μl DNA 溶解液与适量上 样缓冲液混合后，经 1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照； 如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明 DNA 完整性好。 第二节 真核细胞总 RNA 的分离提取 RNA 是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总 RNA 的 80%～85%）、tRNA 和核内小分子 RNA（占 10～15%）、mRNA（占 1～5%）。 其中 mRNA 是分子生物学的主要研究对象，分离制备 mRNA 是克隆基因，分 析基因表达以及建立 cDNA 文库的首要步骤。 真核细胞总 RNA 分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的 RNA 分子，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的关键是尽量减少 RNA 酶 的污染。RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的 RNA 酶外，环境 中也存在 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境
包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA酶,采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶 RNA提取的关键 真核细胞RNA的提取过程有四个关键点,即①样品(细胞或组织)的有 效破碎;②有效地使核蛋白复合体变性;③对内源RNA酶的有效抑制;④有 效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;其中最关键的是抑制RNA酶活 性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。 二、组织RNA提取的基本步骤 1.仪器:匀浆器、低温离心机、离心管。 2试剂:氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲 醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。 3.主要步骤 (1)取组织50-100mg,加0.8 mI trizol冲洗匀浆器,移入同一离心管, 冰上静置5min (2)加0,2m氯仿,充分震荡混匀,静置3min,4℃,12000g×15min离 心。弃沉淀。 (3)取上清,加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀。一20℃静置2h,4℃, 12000g×10min离心。 (4)弃上清,取沉淀,加入lml75%乙醇溶液,漂洗沉淀,4℃,7500g×5min 离心 (5)弃上清,沉淀真空干燥10min。 (6)加40μ L DEPC溶液,充分溶解RNA 4结果鉴定 (1)紫外分光光度计检测:取RNA溶解液,按一定比例稀释后,紫外 分光光度计测定260mm、280nmOD值,计算OD260OD280比值,如果比值在 17~2.0:1之间,说明RNA纯度可
4 包括去除外源性 RNA 酶的污染和抑制内源性 RNA 酶活性。主要是采用 RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin 和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶。 一、RNA 提取 的关键 真核细胞 RNA 的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有 效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源 RNA 酶的有效抑制；④有 效地将 RNA 从 DNA 和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活 性。提取的 RNA 可以用于核酸杂交、cDNA 合成以及体外翻译等。 二、组织 RNA 提取的基本步骤 1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。 2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC 溶液、1%甲醛变性胶、37%甲 醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA 上样缓冲液。 3.主要步骤 （1）取组织 50~100mg，加 0.8ml Trizol 冲洗匀浆器，移入同一离心管， 冰上静置 5min。 （2）加 0.2ml 氯仿，充分震荡混匀，静置 3min，4℃，12000g×15min 离 心。弃沉淀。 （3）取上清，加入 0.5ml 异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置 2h，4℃， 12000g×10min 离心。 （4）弃上清，取沉淀，加入 1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min 离心。 （5）弃上清，沉淀真空干燥 10min。 （6）加 40μl DEPC 溶液，充分溶解 RNA。 4.结果鉴定 （1）紫外分光光度计检测：取 RNA 溶解液，按一定比例稀释后，紫外 分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，如果比值在 1.72.0：1 之间，说明 RNA 纯度可
标准样品当OD260=1时,RNA浓度约为40μgm1,根据下述公式计算RNA 浓度:RNA浓度(μg/ml)=OD26×稀释倍数×40 (2)电泳检测:1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量,电泳槽及制胶板先 用3%过氧化氢浸泡过夜;制1%甲醛变性凝胶板:4.5μRNA,2ul5×甲醛胶 电泳缓冲液,3.5μ37%甲醛,10ul甲酰胺,离心混匀,65℃变性15min后, 迅速置冰浴中;再加入2山RNA上样缓冲液,离心混匀后上样,6V/cm电压, 电泳1~2h:暗室内紫外光下观察,拍照;如果观察到清晰的18S、28SRNA 电泳带,无大量小分子RNA,说明RNA无明显降解,样品一70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h以上,非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后,经高温(15磅,20min)处理灭活RNA酶,所用试剂均用 DEPC水配制,然后高压处理。 2、实验用水要经DEPC处理,但含Tris的试剂不能用DEPC处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套,以避免RNA酶污染。 第三节质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb~200kb的DNA,存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一,获得大量纯化的质粒 DNA是基因克隆的前提条件。 、碱裂解法提取质粒DNA的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为: 共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH12~125时线性 DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂,经酸中和后,共价闭 合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性,只能聚合成网 状结构,离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA 可用乙醇沉淀出来
5 标准样品当 OD260＝1 时，RNA 浓度约为 40μg/ml，根据下述公式计算 RNA 浓度：RNA 浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。 （2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察 RNA 质量，电泳槽及制胶板先 用 3%过氧化氢浸泡过夜；制 1%甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛胶 电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul 甲酰胺，离心混匀，65℃变性 15min 后， 迅速置冰浴中；再加入 2μl RNA 上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm 电压， 电泳 1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的 18S、28S RNA 电泳带，无大量小分子 RNA，说明 RNA 无明显降解，样品－70℃保存备用。 三、注意事项 1、所有玻璃器皿 160～180℃高温干烤 6h 以上，非耐高温器皿经 0.1% DEPC 液浸泡后，经高温（15 磅，20min）处理灭活 RNA 酶，所用试剂均用 DEPC 水配制，然后高压处理。 2、实验用水要经 DEPC 处理，但含 Tris 的试剂不能用 DEPC 处理。 3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免 RNA 酶污染。 第三节 质粒 DNA 的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约 1kb200kb 的 DNA，存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染 色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒 DNA 是基因克隆的前提条件。 一、碱裂解法提取质粒 DNA 的原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为： 共价闭合环状 DNA 与线性 DNA 的拓扑学性质不同。在 PH1212.5 时,线性 DNA 会完全变性,而共价闭合环状 DNA 只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭 合环状 DNA 可迅速准确的复性。而线性 DNA 不能准确复性，只能聚合成网 状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA 一起沉淀下来。上清液中的质粒 DNA 可用乙醇沉淀出来
二、基本步骤 材料:含质粒的大肠杆菌 2.试剂:溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25 mM Tris-HCl(pH8.0),10 MMEDTA(pH 80))、溶液Ⅱ(0.2 N Naoh,1%SDS)用时临时配制。pH48的醋酸钾(KAc) 缓冲液(5MKAc300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH2O至500ml)、T缓冲液 (10 mM Tris-HCl(pH80),1 MMEDTA(pH8.0)、苯酚氯仿/异戊醇(25:24 1)、乙醇(无水乙醇、70%乙醇)、5×TBE(Tris碱54g,硼酸27.5g, EDTA-Na22H204.65g,加ddH2O至1000ml)。10mg/ml溴化乙锭(EB)、 琼脂糖、10mg/ mI rnase a(RNA酶A)、6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝,0.25% 二甲苯青FF,40%(W/)蔗糖水溶液) 3.仪器:离心机、电泳仪、水平式电泳槽 4.主要步骤 (1)挑取LB固体培养基上生长的大肠杆菌单菌落,接种于2.0mlLB(含 相应抗生素)液体培养基中,37℃振荡培养过夜。 (2)取1.5ml培养物转移入微量离心管中,室温离心8000g×lmin,弃上 清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽。 (3)将细菌沉淀重悬于100μ预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡 (4)加200μ新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中,颠倒数次混匀(不要剧烈 振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜充分裂解。 (5)加入150μ预冷的醋酸钾(KAc)缓冲液,将管温和颠倒数次混匀, 见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min。 (6)加入45oμul的苯酚氤仿/异戊醇混合液,振荡混匀,4℃离心12000g l0min。 (7)小心移出上清于另一微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙 醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15mn (8)加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次,4℃离心8000g7min,弃 上清,将沉淀在室温下晾干 (9)沉淀溶于20μTE(含 RNase a2oug/ml),37℃水浴30min以降解 RNA分子,-20℃保存备用 5结果鉴定:1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸DNA的鉴定
6 二、基本步骤 1．材料：含质粒的大肠杆菌 2．试剂：溶液Ⅰ（ 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）)、溶液Ⅱ（0.2N NaOH，1% SDS）用时临时配制。pH 4.8 的醋酸钾（KAc） 缓冲液（5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH2O 至 500ml）、 TE 缓冲液 （10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)）、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24： 1）、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）、 5×TBE（Tris 碱 54g，硼酸 27.5g， EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加 ddH2O 至 1000ml）。10mg/ml 溴化乙锭（EB）、 琼脂糖、10mg/ml RNase A（RNA 酶 A）、6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25% 二甲苯青 FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。 3．仪器：离心机、电泳仪、水平式电泳槽 4.主要步骤 （1）挑取 LB 固体培养基上生长的大肠杆菌单菌落，接种于 2.0ml LB（含 相应抗生素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 （2）取 1.5ml 培养物转移入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上 清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 （3）将细菌沉淀重悬于 100μl 预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 （4）加 200μl 新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中，颠倒数次混匀（不要剧烈 振荡），并将离心管放置于冰上 2-3min，使细胞膜充分裂解。 （5）加入 150μl 预冷的醋酸钾（KAc）缓冲液，将管温和颠倒数次混匀， 见白色絮状沉淀，可在冰上放置 3-5min。 （6）加入 450μl 的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min。 （7）小心移出上清于另一微量离心管中，加入 2.5 倍体积预冷的无水乙 醇，混匀，室温放置 2-5min，4℃离心 12000g×15min。 （8）加入 1ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 2 次，4℃离心 8000g×7min，弃 上清，将沉淀在室温下晾干。 （9）沉淀溶于 20μl TE（含 RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20℃保存备用。 5.结果鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸 DNA 的鉴定
第四节线粒体DNA的提取 线粒体DNA是染色体遗传物质,哺乳类动物的线粒体DNA为共价闭合环 状的双链DNA。它变异快、结构相对简单,经母系遗传,对真核生物基因组 的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近 缘种间或种内种群间亲缘关系的研究 线粒体DNA最早是用氯化铯梯度离心方法获得,该法提取的线粒体DNA 纯度高,但所需仪器设备昂贵,实验周期长,限制其在群体遗传研究中的应用。 继而出现了 Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体DNA的提取方法。 碱变性法线粒体DNA提取的原理 线粒体DNA的结构与质粒DNA的结构相似,均为共价闭合环状的双链 DNA,实验原理与质粒DNA提取相同。 、主要实验步骤 1、材料:新鲜小鼠肝组织 2、仪器:玻璃匀浆器、高速离心机、离心管、吸管 3、试剂:50mmol葡萄糖、10 mmol/L Na2EDTA,25 mmol/L Tris-HCI pH80、1%SDS、0.2 n NaOH、3 M NaAc pH48、95%乙醇、75%乙醇、T缓 冲液 4、主要步骤 (1)取50mg新鲜小鼠肝组织,加lml冷匀浆液,用玻璃匀浆器匀浆, 随即以1000g×3min,4℃,离心,弃沉淀 (2)取上清,12000g×10min,4℃,离心,沉淀即为粗线粒体 (3)将沉淀溶于100ml50mmol/L葡萄糖、10mmol/Na2EDTA,25mmol Tris-HCI pH80)溶液中,充分混匀 (4)加200ml新鲜配制的(1%SDS,0.2 NAoh)溶液,轻轻摇匀,冰 浴5min。 (5)再加150ml(3 M NaAc pH48)溶液,轻轻摇匀,冰浴5min 2000g×10min,4℃,离心
7 第四节 线粒体 DNA 的提取 线粒体 DNA 是染色体遗传物质，哺乳类动物的线粒体 DNA 为共价闭合环 状的双链 DNA。它变异快、结构相对简单，经母系遗传，对真核生物基因组 的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近 缘种间或种内种群间亲缘关系的研究。 线粒体 DNA 最早是用氯化铯梯度离心方法获得，该法提取的线粒体 DNA 纯度高，但所需仪器设备昂贵，实验周期长，限制其在群体遗传研究中的应用。 继而出现了 Triton 法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体 DNA 的提取方法。 一、碱变性法线粒体 DNA 提取的原理 线粒体 DNA 的结构与质粒 DNA 的结构相似，均为共价闭合环状的双链 DNA，实验原理与质粒 DNA 提取相同 。 二、主要实验步骤 1、材料：新鲜小鼠肝组织 2、仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、离心管、吸管 3、试剂：50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%SDS、0.2N NaOH、3M NaAc pH4.8、95%乙醇、75%乙醇、TE 缓 冲液 4、主要步骤 （1）取 50mg 新鲜小鼠肝组织，加 1ml 冷匀浆液，用玻璃匀浆器匀浆， 随即以 1000g×3min， 4℃，离心，弃沉淀。 （2）取上清，12000g×10min，4℃，离心，沉淀即为粗线粒体。 （3）将沉淀溶于 100ml（50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0）溶液中，充分混匀。 （4）加 200ml 新鲜配制的（1%SDS，0.2N NaOH）溶液，轻轻摇匀，冰 浴 5min。 （5）再加 150ml（3M NaAc pH4.8）溶液，轻轻摇匀，冰浴 5min。 12000g×10min，4℃，离心
(6)取上清加等体积(酚、氯仿、异戊醇之体积比为25:24:1)溶液,抽 提2~4次,界面无白色物质,10000g×5min离心 (7)取上清加2倍体积95%乙醇,室温静置15min,然后12000g×10min 离心 (8)弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤1次,以12000g×5min离心。 (9)弃上清,取沉淀,真空干燥后即得线粒体DNA。将其溶于适量的 正缓冲液中,一20℃保存。 5实验结果鉴定 用紫外分光光度仪测定,A260:A280为20左右。若纯度较高,能直接 用限制性内切酶进行酶切图谱分析。 (上海中医药大学王晓玲)
8 （6）取上清加等体积（酚、氯仿、异戊醇之体积比为 25:24:1）溶液，抽 提 2~4 次，界面无白色物质，10000g×5min 离心。 （7）取上清加 2 倍体积 95%乙醇，室温静置 15min，然后 12000g×10min 离心。 （8）弃上清，沉淀用 75%乙醇洗涤 1 次，以 12000g×5min 离心。 （9）弃上清，取沉淀，真空干燥后即得线粒体 DNA。将其溶于适量的 TE 缓冲液中，－20℃保存。 5.实验结果鉴定 用紫外分光光度仪测定，A260：A280 为 2.0 左右。若纯度较高，能直接 用限制性内切酶进行酶切图谱分析。 （上海中医药大学 王晓玲）
