第一章基因诊断 的概念 基因诊断的基本概念 基因诊断是以分子杂交技术为基 础,对基因的结构、表达进行静态或动 态的诊断的方法,其可应用于临床,对 某些遗传病、疾病易感性等进行检测 针对这一概念,在本章我们将对分子杂 交技术、分子诊断、静态、动态诊断、 临床监测和预测进行详述。 分子杂交技术 分子杂交( hybridization)技术是分 子生物学中用于检测生物样本中是否 含有特定的生物分子(探针)的一门技 术。两个生物大分子之间由于化学上的 作用,通过化学键结合在一起。利用分 子杂交原理,可由已知分子制备成探针 ( probe),检测另一分子标点 (target)的存 在与否及含量多少。 根据杂交的分子类型,又可分为 DNA-RNA杂交、 DNA-DNA杂交、 RNA-RNA杂交,抗原抗体杂交、蛋白 质-DNA杂交等等 不同的杂交类型包括了不同的技 术,简述常用分子杂交技术如下,详细 的介绍参见第四章基因诊断技术与 方法(上)。 1.1DNA印迹技术( Southern blotting)
第一章 基因诊断 的概念 基因诊断的基本概念 基因诊断是以分子杂交技术为基 础，对基因的结构、表达进行静态或动 态的诊断的方法，其可应用于临床，对 某些遗传病、疾病易感性等进行检测。 针对这一概念，在本章我们将对分子杂 交技术、分子诊断、静态、动态诊断、 临床监测和预测进行详述。 1 分子杂交技术 分子杂交（hybridization）技术是分 子生物学中用于检测生物样本中是否 含有特定的生物分子（探针）的一门技 术。两个生物大分子之间由于化学上的 作用，通过化学键结合在一起。利用分 子杂交原理，可由已知分子制备成探针 (probe)，检测另一分子标点(target)的存 在与否及含量多少。 根据杂交的分子类型，又可分为 DNA-RNA 杂交、DNA-DNA 杂交、 RNA-RNA 杂交，抗原-抗体杂交、蛋白 质-DNA 杂交等等。 不同的杂交类型包括了不同的技 术，简述常用分子杂交技术如下，详细 的介绍参见 第四章 基因诊断技术与 方法（上）。 1.1 DNA 印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬 菌体的分析 是DNA-DNA杂交,在双链DNA 经热变性成为单链状态以后,在适当的 盐浓度和温度的条件下,由于碱基间重 新形成氢键,两条单链DNA又会恢复 成原来的 Watson- Crick型的双链结构。 不同种类的DNA由于链与链之间碱基 排列不同,放在一起因为对应的部分没 有互补的碱基顺序,所以不能形成双链 结构。因此采用适当的方法,鉴定双链 结构的形成可以了解DNA分子间的碱 基顺序的相同程度。 例 限制藤切、转膜与杂交、显影
用于基因组 DNA、重组质粒和噬 菌体的分析。 是 DNA－DNA 杂交，在双链 DNA 经热变性成为单链状态以后，在适当的 盐浓度和温度的条件下，由于碱基间重 新形成氢键，两条单链 DNA 又会恢复 成原来的 Watson- Crick 型的双链结构。 不同种类的 DNA 由于链与链之间碱基 排列不同，放在一起因为对应的部分没 有互补的碱基顺序，所以不能形成双链 结构。因此采用适当的方法，鉴定双链 结构的形成可以了解 DNA 分子间的碱 基顺序的相同程度。 例： 限制酶切、转膜与杂交、显影
DNA 限制酶消化( HindI) 琼脂糖蓰胶电脉 转移至济酸 纤维滤膜上 加贯量 转移缓计液 3P-DNA探针 硝酸紆维滤膜 分子杂交实验 12RNA印迹技术( Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 是DNA一RNA杂交,将具有互补 的碱基对的DNA单链与RNA单链混 合,给与适当的温度条件和盐浓度,则
1.2 RNA 印迹技术 (Northern blotting) 用于 RNA 的定性定量分析。 是 DNA－RNA 杂交，将具有互补 的碱基对的 DNA 单链与 RNA 单链混 合，给与适当的温度条件和盐浓度，则
碱基间形成氢键,如DNA双链一样, 形成DNA一RNA双链。所以,通过用 适当的方法来测定双链的形成,就可以 检查DNA与RNA间碱基排列的相同 性。此外,也可用某基因DNA来分离 和浓缩相对应的mRNA,或相反地用分 离的mRNA以分离对应的基因DNA 1.3蛋白 质的印迹 分析 (Western otter 用于蛋 白质定性定 量及相互作用研究。 与 Southern或 Northern杂交方 似,但 Western blot采用的是聚丙 胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探 针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到 固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。以固相载体上的蛋白质 或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫 反应,再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应,经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测 蛋白水平的表达 三种印迹技术的比较
碱基间形成氢键，如 DNA 双链一样， 形成 DNA－RNA 双链。所以，通过用 适当的方法来测定双链的形成，就可以 检查 DNA 与 RNA 间碱基排列的相同 性。此外，也可用某基因 DNA 来分离 和浓缩相对应的 mRNA，或相反地用分 离的 mRNA 以分离对应的基因 DNA。 1.3 蛋白 质的印迹 分析 (Western blotting) 用于蛋 白质定性定 量及相互作用研究。 与Southern或Northern杂交方法类 似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰 胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探 针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到 固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。以固相载体上的蛋白质 或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫 反应，再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测 蛋白水平的表达。 三种印迹技术的比较
限制性内切酶 RNA样品 蛋白样品 电泳↓转移杂交 转移到MC膜后与 转移到NC膜或尼龙膜转移到膜或PDP 标记探针杂交 后与标记探针杂交 膜后与抗体反应 放或 射化 自学 显显 影色 DNA印迹 RNA印迹 蛋白印迹 1.4其他 斑点印迹( dot blotting) 这是把受检者DNA变性成单链后 直接点样在硝酸纤维膜上,与标记的基 因探针作固相分子杂交,然后根据杂交 结果是否阳性及其阳性强度,来检定基 因是否存在以及基因的数目。这个方法 比较简便快捷,可适于诊断基因缺失的 遗传病。如正常人的细胞中有4个a珠 蛋白基因,根据受检者DNA与32P标
1.4 其他 斑点印迹 (dot blotting) 这是把受检者 DNA 变性成单链后 直接点样在硝酸纤维膜上，与标记的基 因探针作固相分子杂交，然后根据杂交 结果是否阳性及其阳性强度，来检定基 因是否存在以及基因的数目。这个方法 比较简便快捷，可适于诊断基因缺失的 遗传病。如正常人的细胞中有 4 个 α 珠 蛋白基因，根据受检者 DNA 与 32P 标
记的α珠蛋白基因探针杂交后再按放射 自显影图上的强度与其a基因数量成正 比的原理,便可检测出α珠蛋白基因是 否缺失和缺失程度,以确定有无地中海 贫血病及该病的类型。这一技术的关键 是克隆一批能用于检测人类遗传性疾 病基因诊断的探针 原位杂交( in situ hybridization) 原位杂交主要是基于以下这个主 要原理:单链的DNA或者RNA只要他 们的序列是互补的,即符合AT,CG的 碱基配对原则,那么这样的两条核酸链 之间(DNA-DNA,DNA-RNA, RNA-RNA)就可以形成一个稳定的杂 交复合体。这一原理对于检测一个特异 的mRNA在某一种生物体,或者某些 组织切片、单个细胞里具体表达位置非 常有用。 DNA点阵 (DNA array) 与DNA芯片技。●● 术( DNA chip) ●●●6○ ●●●● 利用微矩 阵技术,将高密 度DNA(DNA 或cDNA)片段阵列通过高速机器人或 原位合成方式以一定的顺序或排列方 式使其附着在如玻璃片、尼龙膜或硅 片等固相表面,借助碱基互补杂交原理 (荧光或核素标记),进行大量的基因 表达及监测等方面研究的一种技术。通 过平面微细加工技术在固体芯片表面 构建的微流体分析单元和系统,以实现 对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组 分的准确、快速、大信息量的检测。这 是继大规模集成电路之后的又一次具 有深远意义的科学技术革命 染色体免疫共沉淀
记的α珠蛋白基因探针杂交后再按放射 自显影图上的强度与其α基因数量成正 比的原理，便可检测出 α 珠蛋白基因是 否缺失和缺失程度，以确定有无地中海 贫血病及该病的类型。这一技术的关键 是克隆一批能用于检测人类遗传性疾 病基因诊断的探针。 原位杂交 (in situ hybridization) 原位杂交主要是基于以下这个主 要原理：单链的 DNA 或者 RNA 只要他 们的序列是互补的，即符合 AT，CG 的 碱基配对原则，那么这样的两条核酸链 之间（DNA-DNA，DNA-RNA， RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂 交复合体。这一原理对于检测一个特异 的 mRNA 在某一种生物体，或者某些 组织切片、单个细胞里具体表达位置非 常有用。 DNA 点阵 (DNA array) 与 DNA 芯片技 术 (DNA chip) 利用微矩 阵技术，将高密 度 DNA （DNA 或 cDNA）片段阵列通过高速机器人或 原位合成方式以一定的顺序或排列方 式使其附着在如玻璃片、 尼龙膜或硅 片等固相表面，借助碱基互补杂交原理 （荧光或核素标记），进行大量的基因 表达及监测等方面研究的一种技术。通 过平面微细加工技术在固体芯片表面 构建的微流体分析单元和系统，以实现 对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组 分的准确、快速、大信息量的检测。这 是继大规模集成电路之后的又一次具 有深远意义的科学技术革命。 染色体免疫共沉淀
Formaldehyde ChIP Target DNA chIP DNA ChIP-PET cross-link 色质免疫沉淀分析 Mapping PET sequences to the genome PET-cluster PET-singleton TFBS oprecipitation,ChP)是一种在体内研究 DNA-蛋白质相互作用的理想方法,相 对于传统的其它研究蛋白与DNA相互 作用的方法,(ChP技术能更加真实、 完整地反映结合在DNA序列上的调控 蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基 且区域或确定与特定基因组区域结 合的蛋白质的最好方法。 右图:新加坡基因组研究人员将 此法与配对端电双标记测序技术 paired-end ditag(PET)sepuencing)#H 结合,获得了65,572个单独的 ChIPDNA片段,建立了用特殊标记标 定p53结合位点的重叠PET簇(PET clusters)
染 色 质 免 疫 沉 淀 分 析 ( c h r o m a t i n i m m u n oprecipitation, ChIP)是一种在体内研究 DNA-蛋白质相互作用的理想方法，相 对于传统的其它研究蛋白与 DNA 相互 作用的方法，ChIP 技术能更加真实、 完整地反映结合在 DNA 序列上的调控 蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基 因组区域或确定与特定基因组区域结 合的蛋白质的最好方法。 右图：新加坡基因组研究人员将 此法与配对端电双标记测序技术 ( paired-end ditag (PET) sepuencing)相 结合，获得了 65，572 个单独的 ChIPDNA 片段，建立了用特殊标记标 定 p53 结合位点的重叠 PET 簇（PET clusters）
2分子诊断 21分子诊断是基因诊断在概念 上的扩展 生物大分子主要指核酸(DNA和 RNA和蛋白质,通过分子水平上DNA RNA或蛋白质的检测,从而对疾病作 出诊断的方法称为分子诊断( molecular diagnosis),分子诊断是基因诊断在概 念上的扩展 基因诊断( genetic diagnosis)以 探测基因的存在,分析生物大分子结 构、含量与功能是否正常,从而达到诊 断疾病的一种方法,是继形态学、生物 化学和免疫学诊断之后的第四代诊断 技术,其诞生与发展得益于分子生物学 理论和技术的迅速发展。基因诊断是用 分子生物学的理论和技术,通过直接探 查基因的存在状态或缺陷,从基因结 构、定位、复制、转录或翻译水平分析 基因的功能,从而对人体状态与疾病作 出诊断的方法。人体基因组的类型早在 受精卵开始时就已形成,因此在人体发 育的任何时期,只要获得受检者的基因 组DNA,应用恰当的DNA分析技术, 便能鉴定出缺陷的基因,而不论该基因 产物是否已经表达。而且,应用这一方 法,不仅能够检测单个碱基置换、缺失 和插入等,还能发现DNA的多态现象 以及遗传病的异质性。基因诊断检测的 目标分子是DNA或RNA,反映基因的 结构和功能。检测的基因有内源性(即机 体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌 等)两种,前者用于诊断基因有无病变, 后者用于诊断有无病原体感染
2 分子诊断 2.1 分子诊断是基因诊断在概念 上的扩展 生物大分子主要指核酸(DNA 和 RNA)和蛋白质，通过分子水平上 DNA, RNA 或蛋白质的检测，从而对疾病作 出诊断的方法称为分子诊断（molecular diagnosis），分子诊断是基因诊断在概 念上的扩展。 基因诊断（genetic diagnosis）以 探测基因的存在，分析生物大分子结 构、含量与功能是否正常，从而达到诊 断疾病的一种方法，是继形态学、生物 化学和免疫学诊断之后的第四代诊断 技术，其诞生与发展得益于分子生物学 理论和技术的迅速发展。基因诊断是用 分子生物学的理论和技术，通过直接探 查基因的存在状态或缺陷，从基因结 构、定位、复制、转录或翻译水平分析 基因的功能，从而对人体状态与疾病作 出诊断的方法。人体基因组的类型早在 受精卵开始时就已形成，因此在人体发 育的任何时期，只要获得受检者的基因 组 DNA，应用恰当的 DNA 分析技术， 便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因 产物是否已经表达。而且，应用这一方 法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失 和插入等，还能发现 DNA 的多态现象 以及遗传病的异质性。基因诊断检测的 目标分子是 DNA 或 RNA，反映基因的 结构和功能。检测的基因有内源性(即机 体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌 等)两种，前者用于诊断基因有无病变， 后者用于诊断有无病原体感染
基因诊断的意义在于不仅能对某 些疾病作出确切诊断,如确定某些遗传 病,也能确定基因与疾病有关联的状 态,如对疾病的易感性、发病类型和阶 段的确定等。就目前已经开展的工作而 言,外科领域的遗传性疾病、遗传易感 性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、 器官移植反应等都可以用基因诊断的 方法加以诊断。 2.2生物大分子结构、含量与功 生物大分子主要有蛋白质、核酸、 酶、维生素等,我们在此简述蛋白质和 核酸的结构与功能。 2.2.1蛋白质 组成蛋白质的20种氨基酸的分类 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸 酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸 天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 半胱氨酸、蛋氨酸
基因诊断的意义在于不仅能对某 些疾病作出确切诊断，如确定某些遗传 病，也能确定基因与疾病有关联的状 态，如对疾病的易感性、发病类型和阶 段的确定等。就目前已经开展的工作而 言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感 性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、 器官移植反应等都可以用基因诊断的 方法加以诊断。 2.2 生物大分子结构、含量与功 能 生物大分子主要有蛋白质、核酸、 酶、维生素等，我们在此简述蛋白质和 核酸的结构与功能。 2.2.1 蛋白质 组成蛋白质的 20 种氨基酸的分类 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、 酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 半胱氨酸、蛋氨酸
NONPOLAR HYDROPHOBIC POLAR UNCHARGED Alanine OOC R GROUPS CH-C H-CH N H3 coo HocH、-cH W=117 NH3 Leucine Ooc OH\ coo CH- CH CH-CH2 CH H3 M=131 COo CH-C HS-cH、-cH N M=131 HN H OoC coo -CH2-CH M131 H NH3 Tryptophan coo CH-CH H3 M=204 Methionine cOo Met CH-CH2CH2-S-CH3ot C-CH2-CH2-C1-NH3 MW=149 POLAR BASIC Mw=115 NHcH2-(H2-CH、N POLAR ACIDIC OoC ∠co C-NH-(CH2)3-Ch CH-CH、 NH2 N MW=133 H Glutamine acid OOC CH-CH.-CH CH.-CH HN HNRNH w=14 肽 两分子氨基酸可借一分子所含的 氨基与另一分子所带的羧基脱去1分子 水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的 氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成 多肽。10个以内氨基酸连接而成多肽称 为寡肽:39个氨基酸残基组成的促肾上
肽 两分子氨基酸可借一分子所含的 氨基与另一分子所带的羧基脱去 1 分子 水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的 氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成 多肽。10 个以内氨基酸连接而成多肽称 为寡肽；39 个氨基酸残基组成的促肾上