第四章基因诊断 技术与方法(上) 基因诊断技术与方法 基因诊断技术主要分为分 杂交技术、聚合酶链反应、DNA测序 技术、荧光原位杂交、生物芯片、免疫 组织化学技术和其他基因诊断技术。以 下我们分别详细介绍。 1分子杂交技术 1.1分子杂交技术的定义 两个分子之间由于化学上的作用, 通过化学键结合在一起称为分子杂交 在生物学上,人们利用这一原理,在将 已知分子制备成带一定可被检测的标 记(如同位素)的条件下,来检测另 分子的存在与否及含量多少等等,称为 分子杂交技术。被标记的分子称为 探针( probe),被检测的分子称为标点 ( target)。利用一条(寡)核苷酸链探针, 可实现对另一种核苷酸链的检测,包括 DNA-RNA、DNA-DNA、RNA-RNA、 抗原与抗体间的分子杂交,蛋白质与 DNA之间的分子杂交等等。这些都是 基因及其产物分析中的常用方法 12分子杂交技术的历史 Hall等于1961年创立:分离 某些标的核酸分子
第四章 基因诊断 技术与方法（上） 基因诊断技术与方法 基因诊断技术主要分为 分子 杂交技术、聚合酶链反应、DNA 测序 技术、荧光原位杂交、生物芯片、免疫 组织化学技术和其他基因诊断技术。以 下我们分别详细介绍。 1 分子杂交技术 1.1 分子杂交技术的定义 两个分子之间由于化学上的作用， 通过化学键结合在一起称为分子杂交。 在生物学上，人们利用这一原理，在将 已知分子制备成带一定可被检测的标 记（如同位素）的条件下，来检测另一 分子的存在与否及含量多少等等，称为 分子杂交技术。 被标记的分子称为 探针(probe)，被检测的分子称为标点 (target)。利用一条（寡）核苷酸链探针， 可实现对另一种核苷酸链的检测，包括 DNA-RNA、DNA-DNA、RNA-RNA、 抗原与抗体间的分子杂交，蛋白质与 DNA 之间的分子杂交等等。这些都是 基因及其产物分析中的常用方法 1.2 分子杂交技术的历史 Hall 等于 1961 年创立：分离 某些标的核酸分子
2年 Bolton等创立了固相 核酸杂交( solid phase hybridization) 1968年 Britten等开始了 DNA-DNA杂交的动力学研究 1972年AvV利用多聚 U- Sepharose和寡聚dT-纤维素 ( cellulose)从总RNA中分离含有多聚 A的mRN 1976年 Weiss等还从网织细胞 ( reticulocyte)RNA中纯化主要为a-珠 蛋白mRNA和β-珠蛋白mRNA的 mRNA混合液,并经寡聚dT引物,以 a-珠蛋白mRNA、B-珠蛋白mRNA为 模板,在RNA依赖的DNA聚合酶(反 转录酶)的作用下合成互补 DNA( complementary dNA,cDNA)探针 来分析珠蛋白基因的表达。由此开始了 利用这一技术进行某些特定基因表达 研究的探索 70年代在细菌中发现限制酶 ( restriction enzyme)或称为限制核内切 核酸酶( (restriction endonuclease) 13分子杂交技术的技术路线 分子杂交技术路线分为1.样 品的分离、纯化。2限制酶及限制酶切 反应。3.探针的制备。4分子杂交 以下我们分别详述各步骤。 13.1样品的分离、纯化 13.1.1核酸的分离、纯化 核酸是遗传信息以及基因表达的 物质基础。它与生命的正常活动,如种 族遗传、生长等有密切联系。它与生命 的异常活动,如肿瘤的发生、放射损伤 以及抗癌、抗病毒药物的作用机理也有 密切的关系。因此,核酸是现代生物化
1962 年 Bolton 等创立了固相 核酸杂交 (solid phase hybridization) 1968 年 Britten 等开始了 DNA-DNA 杂交的动力学研究 1972 年 Aviv 利用多聚 U-Sepharose 和寡聚 dT -纤维素 （cellulose）从总 RNA 中分离含有多聚 A 的 mRNA 1976年Weiss等还从网织细胞 (reticulocyte)RNA 中纯化主要为α-珠 蛋白 mRNA 和β-珠蛋白 mRNA 的 mRNA 混合液，并经寡聚 dT 引物，以 α-珠蛋白 mRNA、β-珠蛋白 mRNA 为 模板，在 RNA 依赖的 DNA 聚合酶（反 转录酶）的作用下合成互补 DNA(complementary DNA，cDNA)探针 来分析珠蛋白基因的表达。由此开始了 利用这一技术进行某些特定基因表达 研究的探索。 70 年代在细菌中发现限制酶 (restriction enzyme)或称为限制核内切 核酸酶(restriction endonuclease)。 1.3 分子杂交技术的技术路线 分子杂交技术路线分为 1.样 品的分离、纯化。 2.限制酶及限制酶切 反应。 3.探针的制备。 4.分子杂交。 以下我们分别详述各步骤。 1.3.1 样品的分离、纯化 1.3.1.1 核酸的分离、纯化 核酸是遗传信息以及基因表达的 物质基础。它与生命的正常活动，如种 族遗传、生长等有密切联系。它与生命 的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤 以及抗癌、抗病毒药物的作用机理也有 密切的关系。因此，核酸是现代生物化
学、生物学与医学的重点研究课题之 核酸分为DNA和RNA两大类。提 取纯化核酸关键在于保持核酸的完整 性。但要做到这一点比较困难,一是因 为细胞内存在活性很高的核糖核酸酶; 二是化学因素,过氧过碱以及其它化学 因素;三是物理因素,如高温、机械牵 拉等可使核酸降解 真核细胞基因组DNA的分离与纯化 DNA主要在细胞核内,核外也有 少量称为核外基因的线粒体DNA等。 真核细胞的DNA分子比原核生物的 DNA分子大得多,并且以核蛋白体形 式存在于细胞中。高等动植物细胞中的 染色体含有大量的DNA,对其结构和 功能的研究又是分子生物学的中心课 题。为了在DNA的研究中获得可靠结 果,制备高纯度大分子量的DNA样品 十分重要的 真核细胞基因组DNA提取的主要 步骤是破碎细胞、去处与核酸结合的蛋 白质、多糖、脂类以及其它不需要的核 酸(RNA)等生物大分子。细胞破碎的 手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎 以及包埋组织的超薄切片等方法。为了 获得大量完整的DNA,一般采用蛋白 酶K和去垢剂SDS等温和的方法破碎 细胞。纯化则根据其本身的特征用不同 方法。细胞基因组DNA的提取是多种 分子生物学和细胞生物学研究的重要 步骤。它对于电镜下研究DNA结果及 用DNA介导的基因转移进行人类基因 定位、原位杂交等方面都很有意义 具体操作方法如下:①动物处死 迅速取出组织块,剪碎后,置入液氮中 ②用冰冷的组织捣碎器捣碎 200~1000mg组织,每100mg组织加入 1.2ml消化液 (100mmol/L NaCl 10mmol/L Tris- HCl, pH8.0, 25mmol/L EDTA 0.5%SDS,0. Img/ml蛋白酶K):③将 悬浮细胞收集,500g×5min离心,或贴
学、生物学与医学的重点研究课题之 一。核酸分为 DNA 和 RNA 两大类。提 取纯化核酸关键在于保持核酸的完整 性。但要做到这一点比较困难，一是因 为细胞内存在活性很高的核糖核酸酶； 二是化学因素，过氧过碱以及其它化学 因素；三是物理因素，如高温、机械牵 拉等可使核酸降解。 真核细胞基因组 DNA 的分离与纯化 DNA 主要在细胞核内，核外也有 少量称为核外基因的线粒体 DNA 等。 真核细胞的 DNA 分子比原核生物的 DNA 分子大得多，并且以核蛋白体形 式存在于细胞中。高等动植物细胞中的 染色体含有大量的 DNA，对其结构和 功能的研究又是分子生物学的中心课 题。为了在 DNA 的研究中获得可靠结 果，制备高纯度大分子量的 DNA 样品 十分重要的。 真核细胞基因组 DNA 提取的主要 步骤是破碎细胞、去处与核酸结合的蛋 白质、多糖、脂类以及其它不需要的核 酸（RNA）等生物大分子。细胞破碎的 手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎 以及包埋组织的超薄切片等方法。为了 获得大量完整的 DNA，一般采用蛋白 酶 K 和去垢剂 SDS 等温和的方法破碎 细胞。纯化则根据其本身的特征用不同 方法。细胞基因组 DNA 的提取是多种 分子生物学和细胞生物学研究的重要 步骤。它对于电镜下研究 DNA 结果及 用 DNA 介导的基因转移进行人类基因 定位、原位杂交等方面都很有意义。 具体操作方法如下：①动物处死， 迅速取出组织块，剪碎后，置入液氮中； ②用冰冷的组织捣碎器捣碎 200~1000mg 组织，每 100mg 组织加入 1.2ml 消化液 （100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris- -HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA， 0.5%SDS，0.1mg/ml 蛋白酶 K）；③将 悬浮细胞收集，500g×5min 离心，或贴
壁细胞用胰酶消化收集离心;④将培养 细胞中加入1~10ml的冰冷的PBS 500g×5min离心,弃上清,重复一次 用一倍体积的消化液悬浮细胞;⑤如细 胞数<3×107,则加入消化液0.3ml:如 细胞数较多,则每108个细胞加入lml 消化液;⑥细胞移入带盖的离心管中 50℃消化12~18h;⑦加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇,混匀,1700g×10min离心 将上层液体移入一个新的离心管中,如 果离心后分层不明显,可再重复消化和 离心;如果离心后,交界面上有一白色 薄膜,再重复酚/氯仿/异戊醇抽提:⑧ 在上清液中加入1/2体积的75moL醋 酸氨,2倍体积的100%乙醇溶液,混匀 12000g离心。为防止大分子基因组 DNA的剪切,加入100倍体积的TE缓 冲反应24h以上,以除去有机溶剂和盐 不需进行步骤⑧;⑨用70%乙醇溶液洗 涤,晾干;溶于适量的TE中,DNA终 浓度为1mlml:⑩加0.1%SDSD和 lpg/ mI rNA酶,37℃孵育h,重复步 骤⑥、⑦。一般1g细胞可得2mg基因 组DNA 真核细胞RNA的分离提取 RNA是基因表达产物。RNA存在 于细胞质中,核糖体最多,细胞核内也 有,主要在核仁部位,线粒体等也有少 量。细胞中的RNA有以下几类分子组 成,rRNA(占细胞总RNA的80%~ 85%)、tRNA和核内小分子RNA(占 10~15%)、mRNA(占1~5%)。其 中mRNA是分子生物学主要的研究对 象。RNA提取工作要求很严,对研究 基因的转录调控、基因的克隆和表达 cDNA文库的构建具有重要作用 分离制备RNA是克隆基因,分析 基因表达以及建立CDNA文库的首要 步骤。从细胞中分离的RNA的质量至 关重要,其中关键是要获得高纯度的 具有充分长度的RNA分子,包括RNA 的纯度和完整性。RNA分离的关键因
壁细胞用胰酶消化收集离心；④将培养 细胞中加入 1~10ml 的冰冷的 PBS， 500g×5min 离心，弃上清，重复一次、 用一倍体积的消化液悬浮细胞；⑤如细 胞数＜3×107，则加入消化液 0.3ml；如 细胞数较多，则每 108 个细胞加入 1ml 消化液；⑥细胞移入带盖的离心管中， 50℃消化 12～18h；⑦加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇，混匀，1700g×10min 离心， 将上层液体移入一个新的离心管中，如 果离心后分层不明显，可再重复消化和 离心；如果离心后，交界面上有一白色 薄膜，再重复酚/氯仿/异戊醇抽提；⑧ 在上清液中加入 1/2 体积的 7.5mol/L 醋 酸氨，2 倍体积的 100%乙醇溶液，混匀， 12000g 离心。为防止大分子基因组 DNA 的剪切，加入 100 倍体积的 TE 缓 冲反应 24h 以上，以除去有机溶剂和盐， 不需进行步骤⑧；⑨用 70%乙醇溶液洗 涤，晾干；溶于适量的 TE 中，DNA 终 浓度为 1ml/ml；⑩加 0.1%SDSD 和 1μg/ml RNA 酶，37℃孵育 1h，重复步 骤⑥、⑦。一般 1g 细胞可得 2mg 基因 组 DNA。 真核细胞 RNA 的分离提取 RNA 是基因表达产物。RNA 存在 于细胞质中，核糖体最多，细胞核内也 有，主要在核仁部位，线粒体等也有少 量。细胞中的 RNA 有以下几类分子组 成，rRNA（占细胞总 RNA 的 80%～ 85%）、tRNA 和核内小分子 RNA（占 10～15%）、mRNA（占 1～5%）。其 中 mRNA 是分子生物学主要的研究对 象。RNA 提取工作要求很严，对研究 基因的转录调控、基因的克隆和表达、 cDNA 文库的构建具有重要作用。 分离制备 RNA 是克隆基因，分析 基因表达以及建立 cDNA 文库的首要 步骤。从细胞中分离的 RNA 的质量至 关重要 ，其中关键是要获得高纯度的 具有充分长度的 RNA 分子，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的关键因
素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定,分布广泛,除细胞内 源性的RNA酶外,环境中也存在RNA 酶。因此在提取RNA时,应尽量创造 个无RNA酶的环境,包括去除外源 性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶 活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白 RNasin和强力的蛋白质变形剂盐酸胍 或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶,采 用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性 RNA酶。主要步骤为将细胞或组织进 行匀浆,目前用已知的最强的RNA酶 抑制剂异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸 钠、巯基乙醇联合抑制RNA酶,并使 核蛋白复合物解离,使RNA易于进入 无DNA的水相,容易被异丙醇浓缩 纯化RNA的方法比较多,有热酚法 氯化铯超离心法等。提取的RNA可以 用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻 译等。 具体操作方法包括:①特殊处理 所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h 以上,非耐高温器皿经0.1%DEPC液 浸泡后,经高温(15磅,20min)处理 灭活RNA酶,所用试剂均用DEPC水 配制,然后高压处理:②取组织 50~100mg,加08 ml triz冲洗匀浆器, 移入同一离心管,冰上静置5min:③加 02nl氯仿,充分震荡混匀,静置3min, 4℃,12000g×15min离心。弃沉淀;④ 取上清,加入0.5m异丙醇,颠倒混匀。 20℃静置2h,4℃,12000g×l0min离 心;⑤弃上清,取沉淀,加入lml75% 乙醇溶液,漂洗沉淀,4℃,7500g×5min 离心;⑥弃上清,沉淀真空干燥10min ⑦加40μDEPC溶液,充分溶解RNA ⑧取2山RNA溶解液,250倍稀释,紫 外分光光度计测定260nm、280nmOD 值,计算OD260OD280比值,如果比值 大于1.7,说明RNA纯度尚可。根据下 述公式计算RNA浓度:RNA浓度 (μg/pl)=OD2ox稀释倍数×40/1000 1%甲醛变性胶电泳观察RNA质 量,电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢 浸泡过夜;制1%甲醛变性凝胶板:4.5μ
素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内 源性的 RNA 酶外，环境中也存在 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造 一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源 性RNA酶的污染和抑制内源性 RNA酶 活性。主要是采用 RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin 和强力的蛋白质变形剂盐酸胍 或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶，采 用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶。主要步骤为将细胞或组织进 行匀浆，目前用已知的最强的 RNA 酶 抑制剂异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸 钠、巯基乙醇联合抑制 RNA 酶，并使 核蛋白复合物解离，使 RNA 易于进入 无 DNA 的水相，容易被异丙醇浓缩。 纯化 RNA 的方法比较多，有热酚法、 氯化铯超离心法等。提取的 RNA 可以 用于核酸杂交、cDNA 合成以及体外翻 译等。 具体操作方法包括：①特殊处理： 所有玻璃器皿 160～180℃高温干烤 6h 以上，非耐高温器皿经 0.1% DEPC 液 浸泡后，经高温（15 磅，20min）处理 灭活 RNA 酶，所用试剂均用 DEPC 水 配制，然后高压处理；②取组织 50~100mg，加 0.8ml Trizol 冲洗匀浆器， 移入同一离心管，冰上静置 5min；③加 0.2ml 氯仿，充分震荡混匀，静置 3min， 4℃，12000g×15min 离心。弃沉淀；④ 取上清，加入 0.5ml 异丙醇，颠倒混匀。 －20℃静置 2h，4℃，12000g×10min 离 心；⑤弃上清，取沉淀，加入 1ml 75% 乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min 离心；⑥弃上清，沉淀真空干燥 10min； ⑦加 40μl DEPC 溶液，充分溶解 RNA； ⑧取 2μl RNA 溶解液，250 倍稀释，紫 外分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，如果比值 大于 1.7，说明 RNA 纯度尚可。根据下 述公式计算 RNA 浓度：RNA 浓度 （μg/μl）＝OD260×稀释倍数×40/1000。 1%甲醛变性胶电泳观察 RNA 质 量，电泳槽及制胶板先用 3%过氧化氢 浸泡过夜；制 1%甲醛变性凝胶板：4.5μl
RNA,2ul5×甲醛胶电泳缓冲液,35ul 37%甲醛,10u甲酰胺,离心混匀,65℃ 变性15min后,迅速置冰浴中;再加入 2山lRNA上样缓冲液,离心混匀后上样 6Vcm电压,电泳1~2h;暗室内紫外 光下观察,拍照;如果观察到清晰的 18S、28SRNA电泳带,无大量小分子 RNA,说明RNA无明显降解,样品 70℃保存备用。 随着科技的发展,也有许多新型 纯化方法,使用试剂盒即可简单的 成分离纯化步骤,如使用纤维素柱纯 化mRNA 使用 Oligo(dn-纤维素层析法提取 poly (A)+RNA Poly(A)-O ligo(dn) 100mM NaCl AIRNA 1mM EDTA 鲜编景搞纯化Poly()mE删圆[ Poly(A)mRNA 1.3.1.2蛋白质的分离、纯化 蛋白质的分离纯化方法很多 根据蛋白质溶解度不同,有 1、盐析法 中性盐对蛋白质的溶解度有显著 影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升
RNA，2ul 5×甲醛胶电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul 甲酰胺，离心混匀，65℃ 变性 15min 后，迅速置冰浴中；再加入 2μl RNA 上样缓冲液，离心混匀后上样， 6V/cm 电压，电泳 1～2h；暗室内紫外 光下观察，拍照；如果观察到清晰的 18S、28S RNA 电泳带，无大量小分子 RNA，说明 RNA 无明显降解，样品－ 70℃保存备用。 随着科技的发展，也有许多新型 纯化方法，使用试剂盒即可简单的完 成分离纯化步骤，如使用纤维素柱纯 化 mRNA： 使用 Poligo(dT)-纤维素层析法提取 poly(A)+RNA TTTTTT TTTTTT TTTTTT TTTTTT AAAAA AAAAA Oligo(dT) 纤维素 Poly(A)--Oligo(dT) 100mM NaCl 洗脱 10mM Tris rRNA/tRNA 1mM EDTA Poly(A)mRNA Total RNA 纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图 1.3.1.2 蛋白质的分离、纯化 蛋白质的分离纯化方法很多： 根据蛋白质溶解度不同，有 1、盐析法 中性盐对蛋白质的溶解度有显著 影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升
高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶 当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度 不同程度下降并先后析出,这种现象称 盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高 浓度的盐离子可夺取蛋白质分子的水 化层,使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出 盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效 果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大 小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓 度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液 中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的 静电斥力最小,因而溶解度也最小,各 种蛋白质的等电点有差别,可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使 之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐 析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇 乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降 低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋 白质较易变性,应在低温下进行。 根据蛋白质分子大小的差别,有 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小 不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力,强 使水和其他小的溶质分子通过半透膜 而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的 滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析, 这是根据分子大小分离蛋白质混合物 最有效的方法之一。柱中最常用的填充
高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度 不同程度下降并先后析出，这种现象称 盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高 浓度的盐离子可夺取蛋白质分子的水 化层，使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效 果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大 小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓 度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液 中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的 静电斥力最小，因而溶解度也最小，各 种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使 之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐 析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇， 乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降 低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋 白质较易变性，应在低温下进行。 根据蛋白质分子大小的差别，有 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小 不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强 使水和其他小的溶质分子通过半透膜， 而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的 滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析， 这是根据分子大小分离蛋白质混合物 最有效的方法之一。柱中最常用的填充
材料是葡萄糖凝胶( Sephadex ged)和 琼脂糖凝胶( agarose gel) 根据蛋白质带电性质不同,有 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下,因 分子量和电荷数量不同而在电场中的 迁移率不同而得以分开。值得重视的是 等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解 质作为载体,电泳时两性电解质形成 个由正极到负极逐渐增加的pH梯度 当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时 到达各自等电点的pH位置就停止,此 法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂和阴 离子交换剂,当被分离的蛋白质溶液流 经离子交换层析柱时,带有与离子交换 剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交 换剂上,随后用改变pH或离子强度办 法将吸附的蛋白质洗脱下来。 根据配体特异性结合,有: 亲和层析法( aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种 极为有效的方法,它经常只需经过一步 处理即可使某种待提纯的蛋白质从很 复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且 纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质 与另一种称为配体( Ligand)的分子能特 异而非共价地结合。其基本原理:蛋白 质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在,每种类型的细胞都含有上千 种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离 ( Separation),提纯( Purification)和 鉴定( Characterization)是生物化学中 的重要的一部分,至今还没的单独或 套现成的方法能移把任何一种蛋白质 从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此 往往采取几种方法联合使用
材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和 琼脂糖凝胶（agarose gel）。 根据蛋白质带电性质不同，有 1、电泳法 各种蛋白质在同一 pH 条件下，因 分子量和电荷数量不同而在电场中的 迁移率不同而得以分开。值得重视的是 等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解 质作为载体，电泳时两性电解质形成一 个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度， 当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时， 到达各自等电点的 pH 位置就停止，此 法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂和阴 离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流 经离子交换层析柱时，带有与离子交换 剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交 换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办 法将吸附的蛋白质洗脱下来。 根据配体特异性结合，有： 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种 极为有效的方法，它经常只需经过一步 处理即可使某种待提纯的蛋白质从很 复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且 纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质 与另一种称为配体(Ligand）的分子能特 异而非共价地结合。其基本原理：蛋白 质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在，每种类型的细胞都含有上千 种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离 （Separation），提纯（Purification）和 鉴定（Characterization）是生物化学中 的重要的一部分，至今还没的单独或一 套现成的方法能移把任何一种蛋白质 从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此 往往采取几种方法联合使用
13.2限制酶及限制酶切反应 13.21限制酶的概念 许多细菌中都具有能识别DNA特 异位点的限制酶,其目的是使带有该特 异位点的外来DNA降解,以保持细菌 自身遗传物质的稳定,是细菌的一种自 我保护机制。然而现代分子生物学技术 则利用限制酶的特异识别与特异切割 特性,建立了重组DNA技术,使人类 基因的克隆、分离、基因的分析、诊断 成为可能 13.22限制酶的类型 I类和Ⅲ类限制酶 具有特异切割活 性,又具有修饰作用 前者需要ATP 它们所切割的部位 往往远离识别部位 Ⅱ类限制酶 它们往往没有修饰 作用 切割时也不需要 ATP提供能量 切割的部位往往与 识别部位相同或邻近 13.22.1类限制酶识别位点的 特点 常为4~6减基,且为迥文对 称( palindromes)(DNA的碱基组成在
1.3.2 限制酶及限制酶切反应 1.3.2.1 限制酶的概念 许多细菌中都具有能识别 DNA 特 异位点的限制酶，其目的是使带有该特 异位点的外来 DNA 降解，以保持细菌 自身遗传物质的稳定，是细菌的一种自 我保护机制。然而现代分子生物学技术 则利用限制酶的特异识别与特异切割 特性，建立了重组 DNA 技术，使人类 基因的克隆、分离、基因的分析、诊断 成为可能。 1.3.2.2 限制酶的类型 Ⅰ类和Ⅲ类限制酶 具有特异切割活 性，又具有修饰作用 前者需要 ATP 它们所切割的部位 往往远离识别部位 Ⅱ类限制酶 它们往往没有修饰 作用 切割时也不需要 ATP 提供能量 切割的部位往往与 识别部位相同或邻近 1.3.2.2.1 Ⅱ类限制酶识别位点的 特点 常为 4~6 减基，且为迥文对 称(palindromes) (DNA 的碱基组成在
双链中,从5→3是相同的),包括四种 类型:①迥文对称;②间隔迥文对称 ( interrupted palindromes),如HnfI、 XmnI:③兼并迥文对称,如 EcoR II HincⅡ,即迥文序列中有个别碱基可有 变化:④非迥文对称,如MboⅡ。 13.222Ⅲ类限制酶的命名原则 般而言,限制酶的名称由 3-4个字母组成,罗马数字表示该酶在 同类酶中的发现次序 13.223类限制酶的部分常用 酶 部分常用限制酶 酶 识别位点·切割位点5→3缓冲液 Aat II GACGT·C Ava I C· YCGRG KLLL Ava ll Bgl I (Msc D) IGG·CCA O(L) Bam h G· ATCC Bgl ll A· GATTI M Bcl I I· GATCA L Bsp1061(Clal) AT·CGAT M(O) Eco RI G· AALTO EcoRII (BstNI) CC(A/TGG M(L GTY·RAC Hind ll A· AGCTI Hinf I ANTC Hpa I GTT·AAC Kpn I GGTAO·C LMLLLoo Mbo ll GAAGANNNNNNN CTTCINNNNNNN GATC Msp I (Hpa II) C·CGG Not i GC· GGCCGO uML CGAT·CG Pyu ll
双链中，从 5’→3’是相同的)，包括四种 类型：① 迥文对称；② 间隔迥文对称 (interrupted palindromes)，如 HinfⅠ、 XmnⅠ；③ 兼并迥文对称，如 EcoRⅡ、 HincⅡ，即迥文序列中有个别碱基可有 变化；④ 非迥文对称，如 MboⅡ。 1.3.2.2.2 Ⅱ类限制酶的命名原则 一般而言，限制酶的名称由 3~4 个字母组成，罗马数字表示该酶在 同类酶中的发现次序 1.3.2.2.3 Ⅱ类限制酶的部分常用 酶 部分常用限制酶： 酶 识别位点·切割位点 5’→3’ 缓 冲 液 Aat II GACGT·C K Alu I AG·CT L Ava I C·YCGRG L Ava II G·G(A/T)CC L Bgl I (Msc I)1 TGG·CCA O(L) Bam HI G·GATCC M Bgl II A·GATCT M Bcl I T·GATCA L Bsp106I (ClaI)1 AT·CGAT M(O) Eco RI G·AATTC M EcoRII (BstNI)1 ·CC(A/T)GG M(L) Hae III GG·CC L Hinc II GTY·RAC L(M) Hind III A·AGCTT L Hinf I G·ANTC L Hpa I GTT·AAC L Kpn I GGTAC·C O Mbo II GAAGANNNNNNN· O CTTCTNNNNNNN· Mbo I (Sau3A)1 ·GATC L(L) Msp I (Hpa II)1 C·CGG O(O) Not I GC·GGCCGC M Pst I CTGCA·G L Pvu I CGAT·CG M Pvu II CAG·CTG M Rsa I CT·AC O Sac I (Sst I)1 GAGCT·C O(L)
