第四章基因治疗 技术与方法 基因治疗技术与方法 1基因转移 将基因转移入相应的靶细胞中是 基因治疗的前提。外源基因是能被转移 入生殖细胞或体细胞的。生殖细胞基因 转移导致基因型的改变,这种改变能代 代相传,所以目前对此有很大的伦理学 上的问题。体细胞基因转移则仅引起个 体的遗传学改变,不涉及后裔 体细胞基因转移 实施体细胞基因转移有两种方法 vⅳvo和 eX VIvO,均已在体细胞基因疗 法中应用过。 Ex vivo法是从病人处收 集细胞,将这些细胞在体外培养并导入 重组基因,然后将这些在遗传上加工的 细胞作为自体移植物重新植回病人体 内。 In vivo法是将重组基因直接送进活 体内各种体细胞中。一般说,基因治疗 的 ex vIvo基因转移可能要比 In vivo基 因转移的许多方法危险性更高些。目前 已经有许多种技术可将基因转移入真 核细胞中,绝大多数仅能用于体细胞基 因疗法 在基因治疗中迄今所应用的基因 转移方法可分为两大类:病毒方法和非 病毒方法。体细胞基因转移的理想方法 是将一定量的任何DNA能以100%的 效率导入任何类型的靶细胞中。此转基 因( transgene)必须或是整合在染色体 中,或是成为稳定的附加体( episome)
第四章 基因治疗 技术与方法 基因治疗技术与方法 1 基因转移 将基因转移入相应的靶细胞中是 基因治疗的前提。外源基因是能被转移 入生殖细胞或体细胞的。生殖细胞基因 转移导致基因型的改变，这种改变能代 代相传，所以目前对此有很大的伦理学 上的问题。体细胞基因转移则仅引起个 体的遗传学改变，不涉及后裔。 体细胞基因转移 实施体细胞基因转移有两种方法： in vivo 和 ex vivo，均已在体细胞基因疗 法中应用过。Ex vivo 法是从病人处收 集细胞，将这些细胞在体外培养并导入 重组基因，然后将这些在遗传上加工的 细胞作为自体移植物重新植回病人体 内。In vivo 法是将重组基因直接送进活 体内各种体细胞中。一般说，基因治疗 的 ex vivo 基因转移可能要比 In vivo 基 因转移的许多方法危险性更高些。目前 已经有许多种技术可将基因转移入真 核细胞中，绝大多数仅能用于体细胞基 因疗法。 在基因治疗中迄今所应用的基因 转移方法可分为两大类：病毒方法和非 病毒方法。体细胞基因转移的理想方法 是将一定量的任何 DNA 能以 100%的 效率导入任何类型的靶细胞中。此转基 因（transgene）必须或是整合在染色体 中，或是成为稳定的附加体（episome）
存在于该被遗传修饰的细胞后裔中,并 且还要在该靶细胞中长时期有效表达 1.1基因转移的非病毒方法 虽然非病毒介导的基因转移效率 低且为瞬时表达,但也相对比较安全 在美国及欧洲一些国家己将此方法用 于临床。先将其发展的主要方法分述如 直接注射法 Biolistic gene gun Tissue plasmid DNA 直接注射法含有 DNA的溶液(或 DNA沉淀物)直接注射入肌肉或甲状 腺及其它器官,使邻近的细胞摄入DNA 和这些基因所编码的产物的表达。在肌 肉中,基因表达可持续数月,但在甲状 腺中却仅能持续3-5天。 Wolf等曾将DNA和RNA表达载 体直接注射到多种组织中,包括血液 肝脏、皮肤、脑和肌肉等。结果以肌肉
存在于该被遗传修饰的细胞后裔中，并 且还要在该靶细胞中长时期有效表达。 1.1 基因转移的非病毒方法 虽然非病毒介导的基因转移效率 低且为瞬时表达，但也相对比较安全， 在美国及欧洲一些国家已将此方法用 于临床。先将其发展的主要方法分述如 下： 1 . 1 . 1 直 接 注 射 法 将 含 有 D N A 的 溶 液 （ 或 DNA 沉淀物）直接注射入肌肉或甲状 腺及其它器官，使邻近的细胞摄入 DNA 和这些基因所编码的产物的表达。在肌 肉中，基因表达可持续数月，但在甲状 腺中却仅能持续 3-5 天。 Wolff 等曾将 DNA 和 RNA 表达载 体直接注射到多种组织中，包括血液、 肝脏、皮肤、脑和肌肉等。结果以肌肉
最为成功。他们发现,注射的DNA在 肌细胞中以环状分子存在,不能复制, 亦不整合入宿主细胞的染色体中。这意 味着肌肉可用外源性DNA注射来做基 因治疗,但不能长久表达该基因;但是 肌肉内注射简单易行,故可以定期肌内 注射DNA。肌细胞是基因治疗的良好 靶细胞,特别对主要涉及肌肉的疾病, 如 Duchenne肌营养不良症(DMD) 但是对非原发于肌肉的疾病可能亦有 效 1.12磷酸钙共沉淀法 此方法由 Graham等人于1973年首 先建立的。当将氯化钙,DNA和磷酸 盐脂缓冲溶液(PBS)在一起缓慢混合 时,即有磷酸钙微细沉淀形成。如有培 养细胞存在时,形成的DNA-磷酸钙沉 淀物能附着在细胞膜上,并经过细胞内 吞作用而进入细胞浆中,并须通过溶酶 体。这些细胞事先要用氯化钙处理,使 其在与DNA样品混合时,核酸可以通 过细胞膜。然后继续培养并将转化子选 择出来。这种转化作用的主要好处是在 于其简单和普通性,其主要缺点是转化 频率通常很低(大约0.01-0.1%),故 需要有一个很强的选择性标志基因 由这类转移方法转入的DNA,大 多不整合入宿主细胞染色体,但能暂时 留在细胞核,以染色体外元件或附加体 的形式存在
最为成功。他们发现，注射的 DNA 在 肌细胞中以环状分子存在，不能复制， 亦不整合入宿主细胞的染色体中。这意 味着肌肉可用外源性 DNA 注射来做基 因治疗，但不能长久表达该基因；但是 肌肉内注射简单易行，故可以定期肌内 注射 DNA。肌细胞是基因治疗的良好 靶细胞，特别对主要涉及肌肉的疾病， 如 Duchenne 肌营养不良症（DMD）。 但是对非原发于肌肉的疾病可能亦有 效。 1.1.2 磷酸钙共沉淀法 此方法由Graham等人于1973年首 先建立的。当将氯化钙，DNA 和磷酸 盐脂缓冲溶液（PBS）在一起缓慢混合 时，即有磷酸钙微细沉淀形成。如有培 养细胞存在时，形成的 DNA-磷酸钙沉 淀物能附着在细胞膜上，并经过细胞内 吞作用而进入细胞浆中，并须通过溶酶 体。这些细胞事先要用氯化钙处理，使 其在与 DNA 样品混合时，核酸可以通 过细胞膜。然后继续培养并将转化子选 择出来。这种转化作用的主要好处是在 于其简单和普通性，其主要缺点是转化 频率通常很低（大约 0.01-0.1%），故 需要有一个很强的选择性标志基因。 由这类转移方法转入的 DNA，大 多不整合入宿主细胞染色体，但能暂时 留在细胞核，以染色体外元件或附加体 的形式存在
1 entrapped nucleic acid Cell membrane destabilization Neath and lipid fusion 脂质体转染法 阳 Cytopl 离子脂质体已经成 为重要的体外基因转移介质。可以在体 内或体外运载外源性遗传物质进入细 胞。阳离子脂质体与中性磷脂与DNA 形成由阳离子脂质包裹DNA的类脂复 合物。其大小、所带电荷及转移的效率 可通过改变复合物中类脂及DNA的组 成进行优化。 脂质体法现已广泛应用于基础研 究。脂质体介导的基因转移的最大优势 在于能在活体内应用,因为传统的 DNA转染法均不能用于活体内转染成 年动物 右图:脂质体介导转染示意图
1 . 1 . 3 脂 质 体 转 染 法 阳 离 子 脂 质 体 已 经 成 为重要的体外基因转移介质。可以在体 内或体外运载外源性遗传物质进入细 胞。阳离子脂质体与中性磷脂与 DNA 形成由阳离子脂质包裹 DNA 的类脂复 合物。其大小、所带电荷及转移的效率 可通过改变复合物中类脂及 DNA 的组 成进行优化。 脂质体法现已广泛应用于基础研 究。脂质体介导的基因转移的最大优势 在于能在活体内应用, 因为传统的 DNA 转染法均不能用于活体内转染成 年动物。 右图：脂质体介导转染示意图
1.14受体介导的基因转移 受体介导的基因转移方法是在质 粒DNA和某种特异的多肽(配体)之 间形成复合体,而这种多肽能被细胞表 面的受体所识别。这种方法使外源基因 可在活体内导向特异类型的细胞。然而 主要的问题是用受体介导的摄入法以 转移基因时,所形成的内产小泡常要被 送到溶酶体中而被降解。然而,通过应 用完整的腺病毒诱导含有DNA的小泡 破裂,可使所转移的DNA保持完整 并使其表达量显著增高。虽然应用受体 介导的基因转移方法所获得的结果很 有希望,但是资料显示,外源基因在活 体内表达是暂时性的。因此目前看来 此方法的应用前途可能有限 1.1.5 显微注射法该操作法分别由 Embryo implanted in uterus of surrogate mother Transgenic Mice
1.1.4 受体介导的基因转移 受体介导的基因转移方法是在质 粒 DNA 和某种特异的多肽（配体）之 间形成复合体，而这种多肽能被细胞表 面的受体所识别。这种方法使外源基因 可在活体内导向特异类型的细胞。然而, 主要的问题是用受体介导的摄入法以 转移基因时，所形成的内产小泡常要被 送到溶酶体中而被降解。然而，通过应 用完整的腺病毒诱导含有 DNA 的小泡 破裂，可使所转移的 DNA 保持完整， 并使其表达量显著增高。虽然应用受体 介导的基因转移方法所获得的结果很 有希望，但是资料显示，外源基因在活 体内表达是暂时性的。因此目前看来， 此方法的应用前途可能有限。 1 . 1 . 5 显 微 注 射 法 该 操 作 法 分 别 由 G r a s
sman和 Dia Cumakes建立。在显微镜 下,将DNA由细胞玻璃针直接注入细 胞。可以将DNA直接注入核内而减少 了溶酶体对外源DNA的消化酶解,有 助于基因的多拷贝整合与表达。由于 DNA是以溶液状态进入细胞的,所 各DNA分子可以以不同方向、不同位 置整合到染色体上,避免了磷酸钙沉淀 法多拷贝中联带来的多拷贝间的顺式 影响,更有利于各份DNA的有效表达 该法适用于将外源基因转入胚胎,制备 转基因动物。由于其转染的细胞数目极 为有限,在体细胞治疗中很少应用 右图:图A示镜下的纤维注射操作 图B为转基因小鼠的制作流程。 1.1.6电穿孔法 它利用脉冲电场将DNA导入培养 细胞.由于电穿孔后进入细胞的DNA
sman 和 Dia Cumakes 建立。在显微镜 下，将 DNA 由细胞玻璃针直接注入细 胞。可以将 DNA 直接注入核内而减少 了溶酶体对外源 DNA 的消化酶解，有 助于基因的多拷贝整合与表达。由于 DNA 是以溶液状态进入细胞的，所以 各 DNA 分子可以以不同方向、不同位 置整合到染色体上，避免了磷酸钙沉淀 法多拷贝中联带来的多拷贝间的顺式 影响，更有利于各份 DNA 的有效表达。 该法适用于将外源基因转入胚胎，制备 转基因动物。由于其转染的细胞数目极 为有限，在体细胞治疗中很少应用。 右图：图 A 示镜下的纤维注射操作。 图 B 为转基因小鼠的制作流程。 1.1.6 电穿孔法 它利用脉冲电场将 DNA 导入培养 细胞. 由于电穿孔后进入细胞的 DNA
拷贝数很有限,所以传代后的细胞外源 基因大多数以单拷贝形式存在可以用 两种方法来增加外源基因在细胞中的 对拷贝数:一,使具有相同的表达产物 基困而不同选择基因的质粒共转染,然 后细胞在含两种选择剂的培养液中培 养,选择后细胞多数含两拷贝的表达产 物基因;其二,用带选择基因和表达产 物基因同仅含表达产物基因的质粒共 转染,两者的量比例前者比后者应越小 越好,并且前者DNA量少一点较好 通过单一选择剂的选择,可望得到多拷 贝的转化细胞 右图:多功能细胞电穿孔仪 1.17微离子轰击法 使用高能微粒子轰击将DNA劲培 养细胞或活的哺乳动物组织内,在贴壁 细胞、悬浮细胞、活体组织中均能很好 表达。亚微粒的钨和金能自发地吸附 DNA,将这些”微弹”加速到很快的速 度轰击细胞。微粒子进入细胞后,DNA 将逐渐从粒子中释放出来,并进行基因 表达。这一方法已用于植物基因工程及 在培养的各类细胞,包括人类表皮细 胞、内皮细胞、成纤维细胞等等。其优 点是可直接对在体器官进行转移,有广 阔应用前景。微粒子轰击后可使104 105的细胞发生DNA整合。 12基因转移的病毒方法 逆转录病毒载体 DNA病毒载体 121逆转录病毒载体
拷贝数很有限, 所以传代后的细胞外源 基因大多数以单拷贝形式存在. 可以用 两种方法来增加外源基因在细胞中的 对拷贝数: 一, 使具有相同的表达产物 基困而不同选择基因的质粒共转染, 然 后细胞在含两种选择剂的培养液中培 养, 选择后细胞多数含两拷贝的表达产 物基因; 其二, 用带选择基因和表达产 物基因同仅含表达产物基因的质粒共 转染, 两者的量比例前者比后者应越小 越好, 并且前者 DNA 量少一点较好, 通过单一选择剂的选择, 可望得到多拷 贝的转化细胞 右图：多功能细胞电穿孔仪 1.1.7 微离子轰击法 使用高能微粒子轰击将 DNA 劲培 养细胞或活的哺乳动物组织内，在贴壁 细胞、悬浮细胞、活体组织中均能很好 表达。亚微粒的钨和金能自发地吸附 DNA，将这些”微弹” 加速到很快的速 度轰击细胞。微粒子进入细胞后，DNA 将逐渐从粒子中释放出来，并进行基因 表达。这一方法已用于植物基因工程及 在培养的各类细胞，包括人类表皮细 胞、内皮细胞、成纤维细胞等等。其优 点是可直接对在体器官进行转移，有广 阔应用前景。微粒子轰击后可使 10-4～ 10-5 的细胞发生 DNA 整合。 1.2 基因转移的病毒方法 逆转录病毒载体 DNA 病毒载体 1.2.1 逆转录病毒载体
反转录病毒( retrovirus)是一类已 知的RNA病毒。该载体系统有两部分 组成,一是带有外源基因的重组反转录 病毒载体分子,二是能以反式提供病毒 结构蛋白的包装细胞,其要求是能高效 产生感染靶细胞的重组病毒颗粒,且无 野生型的反转录病毒存在,后者是基因 治疗安全性的关键问题。 Retrovirus proteins chromosomal 转录病毒载体最大优点是 transection Provirus 染谱广,可以感 染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细 胞、肌细胞等;(2)转入的外源基因可 完全整合;(3)对细胞感染率高,达到 100%;(4)感染细胞不产生病变,可 建立细胞系长期持续表达外源基因。但 也有不足之处,如:(1)只能整合至分 裂相细胞;(2)可插入外源基因片断小 (<10kb),难以满足较大基因的插入; (3)病毒滴度是限制临床应用的主要 方面;(4)有产生野生型病毒或辅助型 病毒的可能,随机整合可能产生不良作 用
反转录病毒（retrovirus）是一类已 知的 RNA 病毒。该载体系统有两部分 组成，一是带有外源基因的重组反转录 病毒载体分子，二是能以反式提供病毒 结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效 产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无 野生型的反转录病毒存在，后者是基因 治疗安全性的关键问题。 逆 转 录 病 毒 载 体 最 大 优 点 是 : （ 1 ） 转 染 谱 广 ， 可 以 感 染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细 胞、肌细胞等;（2）转入的外源基因可 完全整合;（3）对细胞感染率高，达到 100%;（4）感染细胞不产生病变，可 建立细胞系长期持续表达外源基因。但 也有不足之处，如:（1）只能整合至分 裂相细胞;（2）可插入外源基因片断小 （<10kb），难以满足较大基因的插入; （3）病毒滴度是限制临床应用的主要 方面;（4）有产生野生型病毒或辅助型 病毒的可能，随机整合可能产生不良作 用
根据报道利用逆转录病毒作为载 体来进行血友病A的基因治疗已经有 了很大的进展。在累积了大量动物实验 成功的经验基础上,目前已有一个运用 浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型 MO-MLV病毒载体介导FⅧ在体内表 达的Ⅰ期临床试验正在进行之中。1999 年Gao等人在大鼠实验中先肌肉内注 射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基 因(HGF),然后经逆转录病毒转染目 标基因,观察其表达情况。在研究组中 发现血液和肝内有高水平的HGF表 达,且测得3%~12%肝细胞进行分裂 肌肉内注射腺病毒介导的HGF在第1 天浓度最高,此时立刻输注逆转录病毒 介导的β半乳糖苷酶(日标基因),约 有8%肝细胞被转染。这一研究成果给 临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者 带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜 性不同,可将其分为单嗜性逆转录病 毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录 病毒3类,目前研究使用较多的是兼嗜 性逆转录病毒 右图:逆转录病毒的生命周期 122DNA病毒载体 腺病毒载体
根据报道利用逆转录病毒作为载 体来进行血友病 A 的基因治疗已经有 了很大的进展。在累积了大量动物实验 成功的经验基础上，目前已有一个运用 浓缩的含双嗜性病毒外壳蛋白的假型 MO-MLV 病毒载体介导 FⅧ在体内表 达的Ⅰ期临床试验正在进行之中。1999 年 Gao 等人在大鼠实验中先肌肉内注 射由腺病毒介导的肝细胞生长因子基 因（HGF），然后经逆转录病毒转染目 标基因，观察其表达情况。在研究组中 发现血液和肝内有高水平的 HGF 表 达，且测得 3%～12%肝细胞进行分裂。 肌肉内注射腺病毒介导的 HGF 在第 1 天浓度最高，此时立刻输注逆转录病毒 介导的 β 半乳糖苷酶（目标基因），约 有 8%肝细胞被转染。这一研究成果给 临床伴有肝纤维化、肝功失代偿的患者 带来一丝曙光。根据逆转录病毒的亲嗜 性不同，可将其分为单嗜性逆转录病 毒、兼嗜性逆转录病毒和异嗜性逆转录 病毒 3 类，目前研究使用较多的是兼嗜 性逆转录病毒。 右图：逆转录病毒的生命周期 1.2.2 DNA 病毒载体 腺病毒载体
fiber hexon double stranded DNA single-stranded DNA 病毒载体感染宿主的范围比较广,可以感染非分裂 exon 期细胞,在体内疗法的基因转移中具有 很大的优势,而且由于其感染细胞时 DNA不整合到宿主染色体上,不存在 激活致癌基因或插入突变等危险,制备 容易,操作简单,因此倍受人们关注 腺病毒( adenovirus,Ad)是一种 无包膜的线状双链DNA病毒,其复制 不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个 血清型,大多数Ad载体由Ad5和Ad2 构建而来,载体需要在其包装系的帮助 下扩增,另外,通过同源重组的方法, 与一带外源基因和适当的腺病毒序列 的质粒共转染,亦可产生载体。 Ad载体具有以下优点:(1)人类是 Ad的自然宿主,因此比较安全;(2)靶 细胞范围广,不仅能感染复制分裂细 胞,也能感染非分裂细胞,它可介导体 内多种组织的基因转移,如肺、脑、肌 肉、神经系统、血管等;(3)滴度高 可达1011~1012pum;(4)可在肠道 及呼吸道内繁殖,其重组病毒可由静脉 注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方
腺 病 毒 载 体 感 染 宿 主 的 范 围 比 较 广 ， 可 以 感 染 非 分 裂 期细胞，在体内疗法的基因转移中具有 很大的优势，而且由于其感染细胞时 DNA 不整合到宿主染色体上，不存在 激活致癌基因或插入突变等危险，制备 容易，操作简单，因此倍受人们关注。 腺病毒（adenovirus，Ad）是一种 无包膜的线状双链 DNA 病毒，其复制 不依赖于宿主细胞的分裂。有近 50 个 血清型，大多数 Ad 载体由 Ad5 和 Ad2 构建而来，载体需要在其包装系的帮助 下扩增，另外，通过同源重组的方法， 与一带外源基因和适当的腺病毒序列 的质粒共转染，亦可产生载体。 Ad 载体具有以下优点:（1）人类是 Ad 的自然宿主，因此比较安全;（2）靶 细胞范围广，不仅能感染复制分裂细 胞，也能感染非分裂细胞，它可介导体 内多种组织的基因转移，如肺、脑、肌 肉、神经系统、血管等;（3）滴度高， 可达 1011～1012pfu/ml;（4）可在肠道 及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉 注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方