cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和 12-2聚合酶链反应P595 简称PCR( Polymerase Chain Reaction),为DNA体外酶促扩增,又称为无细胞 分子克隆法 (一)PCR基本原理 将DNA聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中,可合成与模板互补的DNA 新链 (1)DNA聚合酶:可采用耐热的 Tag dNA聚合酶。但ag酶无校正功能,PCR产 物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热DNA聚合酶作为商品出售 (2)模板:欲扩增的DNA,通常只需lpg-lng。加热变性后两条链均可作为模版 3)引物:两条模板两个引物。为取得PCR成功首先条件是设计好引物。 ①引物长度应大于16个核苷酸。②Tm>55°。③引物无发夹结构。④两引 物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列。⑤引物中碱基分布均匀,G+C 含量接近50%。 (4)四种dNTP底物 (5)mg2 (二)PCR最适条件 开始在94C加热5~10分钟,使DNA模板完全变性,然后进入热循环。 (1)变性:94C下45秒到1分钟,DNA双链解开。 (2)退火:约9l~92C1分钟,引物与模板两端附着结合。(最适退火温度由实验确 (3)延伸:72C1~1.5分钟,新DNA链形成 最后一次延伸时间10分钟 以上条件用于扩增300~500bp长的DNA片段,若扩增更长的DNA,反应时间可 以适当延长。 (三)PCR技术的发展与应用见P596 广泛用于扩增单个DNA,DNA测序,疾病诊断,人类基因疾病鉴定和法医鉴定等 为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一。cDNA 文库是指细胞全部 mRNA 逆转录成 cDNA 并被克隆的总和。 12-2 聚合酶链反应 P595 简称 PCR（Polymerase Chain Reaction），为 DNA 体外酶促扩增，又称为无细胞 分子克隆法。 （一） PCR 基本原理 将 DNA 聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中，可合成与模板互补的 DNA 新链。 （1） DNA 聚合酶：可采用耐热的 Tag DNA 聚合酶。但 Tag 酶无校正功能，PCR 产 物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热 DNA 聚合酶作为商品出售。 （2） 模板：欲扩增的 DNA，通常只需 1pg~1ng。加热变性后两条链均可作为模版。 （3） 引物：两条模板两个引物。为取得 PCR 成功首先条件是设计好引物。 ① 引物长度应大于 16 个核苷酸。② Tm > 550。③ 引物无发夹结构。④ 两引 物间不应有大于 4bp 以上的互补序列或同源序列。⑤ 引物中碱基分布均匀，G+C 含量接近 50%。 （4） 四种 dNTP 底物。 （5） mg2+。 （二） PCR 最适条件 开始在 940C 加热 5~10 分钟，使 DNA 模板完全变性，然后进入热循环。 （1） 变性：940C 下 45 秒到 1 分钟，DNA 双链解开。 （2） 退火：约 91~920C 1 分钟，引物与模板两端附着结合。（最适退火温度由实验确 定） （3） 延伸：720C 1~1.5 分钟，新 DNA 链形成。 最后一次延伸时间 10 分钟。 以上条件用于扩增 300~500bp 长的 DNA 片段，若扩增更长的 DNA，反应时间可 以适当延长。 （三）PCR 技术的发展与应用 见 P596 广泛用于扩增单个 DNA，DNA 测序，疾病诊断，人类基因疾病鉴定和法医鉴定等， 为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一