第十二章基因工程下册P580 1基因工程 是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程,包括基因重组、克隆和 表达。核心是构建重组体DNA的技术 (一)DNA克隆 将DNA限制酶切片段插入克隆载体,导入宿主细胞,经无性繁殖以获得相同 的DNA扩增分子 (1)DNA限制酶和连接酶 限制酶可将DNA切割成平末端或黏性末端,互补黏性末端之间碱基配可促 使连接反应容易进行。 相容的限制片段可用DNA连接酶相连接,DNA的黏性末端和平末端连接见 P582图40-1。 (2)分子克隆的载体与宿主系统: 载体:将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。 克隆载体通常是由质粒、病毒(如λ-噬菌体)或一段染色体DNA改建而成。 质粒是染色体外自主复制的遗传因子,多为共价闭环DNA分子,常用作细 菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒DNA,制备一个具黏性末端 的开环质粒分子。 作为克隆载体应具有自主复制能力,有易于筛选的选择标记,如含有抗药基 宿主细胞应根据载体的性质来选定,应易于接受外源DNA,且易于生长和筛 (3)外源基因导入宿主细胞: 欲引入的外源目标DNA经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端,用连 接酶将外源DNA片段和载体连接成外源基因。 用CaCl2等方法,使E.coli等宿主细胞处于感受态,从而将外源基因导入细胞。 此外还有电穿孔法等使外源DNA高效导入细胞 最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆(可按重组体某种特征, 如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每 个菌落的细胞将含有同样的重组质粒DNA,这些质粒DNA又含有同样外源 DNA片段) (二)基因文库 (1)基因文库的构建:P589 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和 理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息 基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组 DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤 2构是析的,需经则A后加工过程才使编序列拼在 起。若将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA(cDNA),接上原核生 物表达控制元件,在原核生物表达 通过cDNA还可研究不稳定的mRNA
第十二章 基因工程 下册 P580 12-1 基因工程 是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和 表达。核心是构建重组体 DNA 的技术。 （一） DNA 克隆 将 DNA 限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖以获得相同 的 DNA 扩增分子。 （1） DNA 限制酶和连接酶： 限制酶可将 DNA 切割成平末端或黏性末端，互补黏性末端之间碱基配可促 使连接反应容易进行。 相容的限制片段可用 DNA 连接酶相连接，DNA 的黏性末端和平末端连接见 P582 图 40-1。 （2） 分子克隆的载体与宿主系统： 载体：将外源 DNA 带入宿主细胞并进行复制的运载工具。 克隆载体通常是由质粒、病毒（如λ-噬菌体）或一段染色体 DNA 改建而成。 质粒是染色体外自主复制的遗传因子，多为共价闭环 DNA 分子，常用作细 菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒 DNA，制备一个具黏性末端 的开环质粒分子。 作为克隆载体应具有自主复制能力，有易于筛选的选择标记，如含有抗药基 因等。 宿主细胞应根据载体的性质来选定，应易于接受外源 DNA，且易于生长和筛 选。 （3） 外源基因导入宿主细胞： 欲引入的外源目标 DNA 经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端，用连 接酶将外源 DNA 片段和载体连接成外源基因。 用 CaCl2 等方法,使 E. coli 等宿主细胞处于感受态，从而将外源基因导入细胞。 此外还有电穿孔法等使外源 DNA 高效导入细胞。 最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆（可按重组体某种特征， 如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每 个菌落的细胞将含有同样的重组质粒 DNA，这些质粒 DNA 又含有同样外源 DNA 片段）。 （二） 基因文库 （1） 基因文库的构建： P589 基因文库是指整套由基因组 DNA 片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。 理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。 基因文库的构建包括基因组 DNA 的随机片段化、载体 DNA 的制备、重组 DNA 的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。 （2） cDNA 文库的构建： 真核生物基因是断裂的，需经 RNA 转录后加工过程才使编码序列拼接在一 起。若将加工成熟的 mRNA 经逆转录合成互补的 DNA（cDNA），接上原核生 物表达控制元件，在原核生物表达。 通过 cDNA 还可研究不稳定的 mRNA
cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和 12-2聚合酶链反应P595 简称PCR( Polymerase Chain Reaction),为DNA体外酶促扩增,又称为无细胞 分子克隆法 (一)PCR基本原理 将DNA聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中,可合成与模板互补的DNA 新链 (1)DNA聚合酶:可采用耐热的 Tag dNA聚合酶。但ag酶无校正功能,PCR产 物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热DNA聚合酶作为商品出售 (2)模板:欲扩增的DNA,通常只需lpg-lng。加热变性后两条链均可作为模版 3)引物:两条模板两个引物。为取得PCR成功首先条件是设计好引物。 ①引物长度应大于16个核苷酸。②Tm>55°。③引物无发夹结构。④两引 物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列。⑤引物中碱基分布均匀,G+C 含量接近50%。 (4)四种dNTP底物 (5)mg2 (二)PCR最适条件 开始在94C加热5~10分钟,使DNA模板完全变性,然后进入热循环。 (1)变性:94C下45秒到1分钟,DNA双链解开。 (2)退火:约9l~92C1分钟,引物与模板两端附着结合。(最适退火温度由实验确 (3)延伸:72C1~1.5分钟,新DNA链形成 最后一次延伸时间10分钟 以上条件用于扩增300~500bp长的DNA片段,若扩增更长的DNA,反应时间可 以适当延长。 (三)PCR技术的发展与应用见P596 广泛用于扩增单个DNA,DNA测序,疾病诊断,人类基因疾病鉴定和法医鉴定等 为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一
cDNA 文库是指细胞全部 mRNA 逆转录成 cDNA 并被克隆的总和。 12-2 聚合酶链反应 P595 简称 PCR（Polymerase Chain Reaction），为 DNA 体外酶促扩增，又称为无细胞 分子克隆法。 （一） PCR 基本原理 将 DNA 聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中，可合成与模板互补的 DNA 新链。 （1） DNA 聚合酶：可采用耐热的 Tag DNA 聚合酶。但 Tag 酶无校正功能，PCR 产 物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热 DNA 聚合酶作为商品出售。 （2） 模板：欲扩增的 DNA，通常只需 1pg~1ng。加热变性后两条链均可作为模版。 （3） 引物：两条模板两个引物。为取得 PCR 成功首先条件是设计好引物。 ① 引物长度应大于 16 个核苷酸。② Tm > 550。③ 引物无发夹结构。④ 两引 物间不应有大于 4bp 以上的互补序列或同源序列。⑤ 引物中碱基分布均匀，G+C 含量接近 50%。 （4） 四种 dNTP 底物。 （5） mg2+。 （二） PCR 最适条件 开始在 940C 加热 5~10 分钟，使 DNA 模板完全变性，然后进入热循环。 （1） 变性：940C 下 45 秒到 1 分钟，DNA 双链解开。 （2） 退火：约 91~920C 1 分钟，引物与模板两端附着结合。（最适退火温度由实验确 定） （3） 延伸：720C 1~1.5 分钟，新 DNA 链形成。 最后一次延伸时间 10 分钟。 以上条件用于扩增 300~500bp 长的 DNA 片段，若扩增更长的 DNA，反应时间可 以适当延长。 （三）PCR 技术的发展与应用 见 P596 广泛用于扩增单个 DNA，DNA 测序，疾病诊断，人类基因疾病鉴定和法医鉴定等， 为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一
