§28酶促反应动力学(9章P351) (一)底物浓度对酶反应速率的影响 用反应初速度ⅴ对底物浓度[S]作图得P355图9-6 曲线分以下几段: (1)OA段:反应底物浓度较低时v与[S]成正比,表现为一级反应,v=k[S]。 根据酶底物中间络合物学说,酶催化反应时,首先和底物结合生成中间 复合物ES,然后再生成产物P,并释放出E E+S= ES P+E OA段上,底物浓度小,酶未被底物饱和,有剩余酶,反应速率取决于 ES浓度,与[S]呈线性关系,V正比于[S]。 (2)AB段:反应速度不再按正比升高,表现为混合级反应。此时酶渐渐为 底物饱和,[ES]慢慢增加,ⅴ也慢慢增加,为分数级反应。 (3)BC段:反应速度趋于Vmx,为零级反应,酶促反应表现出饱和现象 此时底物过量[S]>[E],[E]己全部转为[ES]而恒定,因此反应速率也恒 定,为最大反应速率,Vmax为[E所决定。 非催化反应无此饱和现象。 酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。 (二)酶促反应力学方程式 (1)米氏方程推导 1913年 Michaelis和 Menten提出并推导出表示[S]与v之间定量关系 的米氏方程 Vmax[S] Km:米氏常数,物理意义为反应速率为最大速率Vma一半时底物的 浓度,单位与底物浓度同 推导:酶促反应分两步进行 E+S ES P+E V=k3 eS] 般k为限速步骤ⅴ=k[ES]…① 1.[ES]生成速率 d[esydt=kI([E]-[] [S] 2.[ES]分解速率: -d[esj/dt=k2 [ES]+ k3 ES]=(k2+ k3)ES 3.稳态下[S]不变,ES生成速率和分解速率相等: k1(E}-[ES])[S]=(k2+k3)[ES 4.引入Km:令Km=k2+k3/k 代入Km=(E}-[ES])[S]/[ES] Km ES]=EIs-IS ES], ES](Km+S)=E], ES]=E][S]/Km+S], 5.代入①式:V=k3[ES]=kE]S]/Km+S]…② 6.引入Vmax:为所有酶都被底物饱和时的反应速率,即此时E}[ES]
§2.8 酶促反应动力学 （9 章 P351） （一）底物浓度对酶反应速率的影响 用反应初速度 v 对底物浓度[S]作图得 P355 图 9-6。 曲线分以下几段： （1） OA 段：反应底物浓度较低时 v 与[S]成正比，表现为一级反应，v = k[S]。 根据酶底物中间络合物学说，酶催化反应时，首先和底物结合生成中间 复合物 ES，然后再生成产物 P，并释放出 E。 E + S = ES → P + E OA 段上，底物浓度小，酶未被底物饱和，有剩余酶，反应速率取决于 ES 浓度，与[S]呈线性关系，v 正比于[S]。 （2） AB 段：反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应。此时酶渐渐为 底物饱和，[ES]慢慢增加，v 也慢慢增加，为分数级反应。 （3） BC 段：反应速度趋于 Vmax，为零级反应，酶促反应表现出饱和现象。 此时底物过量[S]>[E], [E]已全部转为[ES]而恒定，因此反应速率也恒 定，为最大反应速率，Vmax 为[E]所决定。 非催化反应无此饱和现象。 酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。 （二）酶促反应力学方程式 （1） 米氏方程推导 1913 年 Michaelis 和 Menten 提出并推导出表示[S]与 v 之间定量关系 的米氏方程 Vmax[S] V = Km + [S] Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率 Vmax 一半时底物的 浓度，单位与底物浓度同。 推导：酶促反应分两步进行。 k1 k3 E + S ES → P + E k2 v = k3 [ES] 一般 k3 为限速步骤 v = k3 [ES] … ① 1. [ES] 生成速率： d[ES]/dt = k1([E] - [ES]) [S] 2. [ES]分解速率： -d[ES] / dt = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3) [ES] 3. 稳态下[ES]不变，ES 生成速率和分解速率相等： k1 ([E]- [ES]) [S] = (k2+k3) [ES] 4. 引入 Km： 令 Km = k2+k3 / k1 代入 Km = ([E]- [ES]) [S] / [ES] , Km [ES] = [E] [S]- [S] [ES], [ES] (Km + S) = [E] [S], [ES] = [E] [S] / Km+[S], 5. 代入①式：v = k3 [ES] = k3 [E] [S] / Km + [S] … ② 6. 引入 Vmax：为所有酶都被底物饱和时的反应速率，即此时[E]= [ES]
Vmax=k3 ES]=k3 E] 代入②式:v= Vmax [s]/Km+S] 米氏方程表示Km及Vmax已知时,v[S]的定量关系。 (2)米氏常数的意义 1.Km是酶的一个特性常数,Km大小只与酶性质有关,而与酶浓度无关 当底物确定,反应温度,pH及离子强度一定时,Km值为常数,可用来鉴 别酶。P359表9-1列出一些酶的Km值。一般Km在1×106~10mol 之间。 不同的酶Km值不同,测定Km要在相同测定条件(pH、温度、离子 强度)下进行。 2.Km值可用于判断酶的专一性和天然产物,若一个酶有几种底物就有 几个Km值,其中Kn值最小的底物称为该酶的最适底物,又称天然底物。 3.1/Km可近似表示酶与底物亲和力的大小 真正表示酶与底物亲和力为K=k2/k1,注Km=k2+k3/k) 4.已知Km可由[S]计算v,或由v计算[S] 5.Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。 Km小的为主要催化方向(正、逆两方向反应Km不同)。 (3)Vmax和k(kat)的意义 酶浓度[E]一定,则对特定底物Vm为一常数。催化常数kat又称酶 的转化数,数值上与k3同,为酶被底物饱和时,每秒钟每个酶分子转换 底物的分子数。 大多数酶的kcat为1-~104sec,见P322表8-2,为每秒钟酶促反应每 微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。kcat越大,酶催化效率越高 (4)kea/Km的意义: 生理条件下S<Km,Vmax=katE] 得出:v=k/KmE/sy4y 代入米氏方程ⅴ=kaE]S]/Km+[S]=kcaE][S]/Km kat/Km为[E]和S]反应形成产物的表观二级速度常数,单位:L/mols 可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,见P362表9-4。 ka/Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率 (三)米氏常数求法 (1)双倒数法 1/v=Km /Vmax X1/S]+1/vmax 以1/v~1/[S]作图,见P363图910 纵轴截距:1/Vmax;横轴截距:-1/Km:斜率:Km/Vmax。 (2)v-v/Sz (Ead ic-Hofstee ) V=Km×v/[S]+Vmax以y~V/S]作图,见P363图9-1l。 斜率:Km;纵轴截距:Ⅴmax;横轴截距:Ⅴax/Km (3)[S]/v-[S]iE(Hanes-Woolf) [S]/v=Km/Vmax+ 1/Vmax X [SI 以[S]/v~[S]作图,见P363图9-12 斜率:I/V灬欲;纵轴截距:Km/Vma;横轴截距:-Km §29酶的抑制作用
Vmax = k3 [ES] = k3 [E] 代入②式：v = Vmax [S] / Km + [S] 米氏方程表示 Km 及 Vmax已知时，v~[S]的定量关系。 （2） 米氏常数的意义 1. Km 是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。 当底物确定，反应温度，pH 及离子强度一定时，Km 值为常数，可用来鉴 别酶。P359 表 9-1 列出一些酶的 Km 值。一般 Km 在 1×10-6~10-1mol/L 之间。 不同的酶 Km 值不同，测定 Km 要在相同测定条件（pH、温度、离子 强度）下进行。 2. Km 值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有 几个 Km 值，其中 Km 值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。 3. 1 / Km 可近似表示酶与底物亲和力的大小。 真正表示酶与底物亲和力为 Ks=k2 / k1 ,(注 Km= k2+k3 / k1)。 4. 已知 Km 可由[S]计算 v，或由 v 计算[S]。 5. Km 可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。 Km 小的为主要催化方向（正、逆两方向反应 Km 不同）。 （3） Vmax 和 k3(kcat)的意义： 酶浓度[E]一定，则对特定底物 Vmax 为一常数。催化常数 kcat 又称酶 的转化数，数值上与 k3 同，为酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换 底物的分子数。 大多数酶的 kcat 为 1~104 /sec，见 P322 表 8-2，为每秒钟酶促反应每 微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。kcat 越大，酶催化效率越高。 （4） kcat / Km 的意义： 生理条件下 S << Km， Vmax = kcat [E] 代入米氏方程 v = kcat [E] [S] / Km + [S] = kcat [E] [S] / Km 得出：v = kcat / Km[E][S] kcat / Km 为[E]和[S]反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mol s。 可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率，见 P362 表 9-4。 kcat / Km 大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。 （三）米氏常数求法： （1） 双倒数法： 1 / v = Km / Vmax×1 /[S] + 1 / Vmax 以 1 / v ~ 1 / [S]作图，见 P363 图 9-10 纵轴截距：1 / Vmax；横轴截距：-1 / Km；斜率：Km / Vmax。 （2）v ~ v / [S]法 （Eadic-Hofstee）： v = -Km×v / [S] +Vmax 以 v ~ v / [S]作图，见 P363 图 9-11。 斜率：-Km；纵轴截距：Vmax；横轴截距：Vmax / Km。 （3）[S] / v ~ [S]法 （Hanes-Woolf）： [S] / v = Km / Vmax + 1 / Vmax×[S] 以[S] / v ~ [S]作图，见 P363 图 9-12 斜率：1 / Vmax；纵轴截距：Km / Vmax；横轴截距：-Km。 §2.9 酶的抑制作用
失活作用:使酶蛋白变性而引起酶活力丧失。 抑制作用:酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失,但不 引起酶蛋白变性。 引起抑制作用的物质称为抑制剂。研究酶的抑制剂,可以研究酶的结 构与功能、酶催化机制,进行药物、农药的设计与筛选 (一)抑制作用的类型 (1)不可逆抑制作用 抑制剂与酶必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失,不能用透析、 超过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活,酶被化学修饰。 (2)可逆抑制作用 抑制剂与酶以非共价键结合而使酶活力降低或丧失,能用物理方法除 去抑制剂而使酶复活。 可逆抑制又分为三种类型,如P369图9-17所示。 竞争性抑制:抑制剂(Ⅰ)和底物(S)竞争酶的结合部位,从而影响了 底物与酶的正常结合。 抑制剂结构大多与底物类似,许多底物过渡态类似物为抑制剂。抑制 剂与酶活性部位结合形成EI复合物,抑制酶与底物的结合。竞争性抑制可 以通过增加底物浓度而解除,如丙二酸或戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。 2.非竞争性抑制:底物和抑制剂同时和酶结合,两者无竞争作用。I与S 结构无共同之处,酶活性降低或被抑制,不能用增加底物浓度来解除抑制, 如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂 3.反竞争性抑制:酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。常见于多底物 反应中,如肼类化合物抑制胃蛋白酶 (二)可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学鉴别 加入一定量抑制剂,以ⅴ与酶浓度[]作图,见P370图9-8 加不可逆抑制剂使直线原点右移,斜率不变,加入酶使浓度大于不可逆 抑制剂,才表现酶活力:加可逆抑制剂,直线原点不动,斜率变小 (三)可逆抑制作用动力学 (1)竞争性抑制:1/~1S]作图见P371图920,Vmax不变,Km变大。 纵轴截距:1NVm不变,Ⅴa不变,底物浓度足够高,可克服抑制作 用;横轴截距:1/Km变小,Km变大;斜率:Km/Vmax变大。 (2)非竞争性抑制:1/~1/S]作图见P372图9-21,Vma变小,Km不变 纵轴截距:1ⅣVm变大,Vm变小;横轴截距:-1/Km不变,Km不 变;斜率:Km/Vmax变大。 (3)反竞争性抑制:1/~1/S]作图见P373图922,Km,Vm都变小 (四)一些重要的抑制剂 (1)不可逆抑制剂 有机磷化合物:与脂酶活性部位 Ser-Oh共价结合,如抑制胆碱酯酶, 使乙酰胆碱不能分解而积累,使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统 处于过于兴奋状态,引起神经中毒。 如神经毒剂和有机磷农药,结构式见P374 可用能与磷酸根有更强结合力的化合物将酶游离出,从而解毒,如用 肟类化合物解磷定,结构式见P374。 2.有机砷化合物:与酶中 Cys-SH作用使人畜中毒。如有机砷化合物路
失活作用：使酶蛋白变性而引起酶活力丧失。 抑制作用：酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失，但不 引起酶蛋白变性。 引起抑制作用的物质称为抑制剂。研究酶的抑制剂，可以研究酶的结 构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选。 （一）抑制作用的类型： （1） 不可逆抑制作用： 抑制剂与酶必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、 超过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，酶被化学修饰。 （2） 可逆抑制作用： 抑制剂与酶以非共价键结合而使酶活力降低或丧失，能用物理方法除 去抑制剂而使酶复活。 可逆抑制又分为三种类型，如 P369 图 9-17 所示。 1. 竞争性抑制：抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了 底物与酶的正常结合。 抑制剂结构大多与底物类似，许多底物过渡态类似物为抑制剂。抑制 剂与酶活性部位结合形成 EI 复合物，抑制酶与底物的结合。竞争性抑制可 以通过增加底物浓度而解除，如丙二酸或戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。 2. 非竞争性抑制：底物和抑制剂同时和酶结合，两者无竞争作用。I 与 S 结构无共同之处，酶活性降低或被抑制，不能用增加底物浓度来解除抑制， 如 Leu 是精氨酸酶非竞争性抑制剂。 3. 反竞争性抑制：酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。常见于多底物 反应中，如肼类化合物抑制胃蛋白酶。 （二）可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学鉴别 加入一定量抑制剂，以 v 与酶浓度[E]作图，见 P370 图 9-8。 加不可逆抑制剂使直线原点右移，斜率不变，加入酶使浓度大于不可逆 抑制剂，才表现酶活力；加可逆抑制剂，直线原点不动，斜率变小。 （三）可逆抑制作用动力学 （1） 竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见 P371 图 9-20，Vmax 不变，Km 变大。 纵轴截距：1 /Vmax 不变，Vmax 不变，底物浓度足够高，可克服抑制作 用；横轴截距：1 /Km 变小，Km 变大；斜率：Km / Vmax 变大。 （2） 非竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见 P372 图 9-21，Vmax 变小，Km 不变。 纵轴截距：1 /Vmax 变大，Vmax 变小；横轴截距：-1 /Km 不变，Km 不 变；斜率：Km / Vmax 变大。 （3） 反竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见 P373 图 9-22，Km，Vmax 都变小。 （四） 一些重要的抑制剂： （1） 不可逆抑制剂： 1. 有机磷化合物：与脂酶活性部位 Ser–OH 共价结合，如抑制胆碱酯酶， 使乙酰胆碱不能分解而积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统 处于过于兴奋状态，引起神经中毒。 如神经毒剂和有机磷农药，结构式见 P374。 可用能与磷酸根有更强结合力的化合物将酶游离出，从而解毒，如用 肟类化合物解磷定，结构式见 P374。 2. 有机砷化合物：与酶中 Cys-SH 作用使人畜中毒。如有机砷化合物路
易斯毒气(结构式见P375),可用含SH的化合物作解毒剂,使酶恢复 活性。 3.氰化物、CO、H2S与含铁卟啉的酶,如细胞色素氧化酶中的Fe2+络 合,使酶失活,阻止呼吸 4.青霉素:与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合,使酶失活,(P375 图9-24)抑制细菌细胞壁合成。青霉素与转肽酶的底物之一的酰基 D-Ala-D-Ala结构类似,见P546。 5.TLCK:根据底物的化学结构设计的专一性不可逆抑制剂。以胰蛋白 酶底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯(TLME)为模板,设计底物结构类似 物对甲苯磺酰冮Ⅰ-赖氨酰氯甲酮(∏LCK)(结构见P376图925),与胰 蛋白酶活性部位Hss7共价结合,引起不可逆失活 (2)可逆抑制剂: 磺胺药:四氢叶酸(THF)是合成核酸和蛋白质酶的必需物质(辅酶)。 根据人和细菌获TF途径不同设计磺胺类杀菌剂。叶酸(FA)结构见 P377,DHF(二氢叶酸)、THF见P457图1130。 FA还原酶 DHF还原酶 叶酸 DHF THE (人可从食物中获取)DHF合成酶 对氨基苯甲酸(细菌靠此合成THF) 人体可直接从食物获取叶酸经DHF还原成THF而细菌只能从对氨基 苯甲酸合成DHA。因此若抑制DHF合成酶,即可断绝细菌THF来源, 从而抑制核酸和蛋白质的合成,而抗菌 THF中对氨基苯甲酰胺部分的过渡态类似物对氨基苯磺酰胺可抑制 DHF合成酶 磺胺药抗菌谱广,性质稳定,对肺炎、痢疾等疗效显著。 此外抗癌药阿糖胞苷、氨甲喋呤等均为酶的竞争性抑制剂。 §210温度、pH等对酶反应影响 (一)酶反应最适温度:使酶促反应速度达最大值的温度,见P378图9-28, 般为钟罩形曲线。 每种酶在一定条件下都有其最适温度,动物一般35~40C,植物40~50C, 微生物则差别较大,最高可达70C (二)最适pH:在此p下酶促反应有最大速率。见P379图9-29,钟罩形曲 线 般酶最适pH在5-8之间,动物65-80,植物及微生物45-65 (三)激活剂:凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂,大部分是无机离子或 简单有机化合物 不同的酶可有不同激活剂
易斯毒气（结构式见 P375），可用含-SH 的化合物作解毒剂，使酶恢复 活性。 3. 氰化物、CO、H2S 与含铁卟啉的酶，如细胞色素氧化酶中的 Fe2+络 合，使酶失活，阻止呼吸。 4. 青霉素：与糖肽转肽酶活性部位 Ser-OH 共价结合，使酶失活，（P375 图 9-24）抑制细菌细胞壁合成。青霉素与转肽酶的底物之一的酰基 -D-Ala-D-Ala 结构类似，见 P546。 5. TLCK：根据底物的化学结构设计的专一性不可逆抑制剂。以胰蛋白 酶底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯（TLME）为模板，设计底物结构类似 物对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）（结构见 P376 图 9-25），与胰 蛋白酶活性部位 His57 共价结合，引起不可逆失活。 （2） 可逆抑制剂： 磺胺药：四氢叶酸（THF）是合成核酸和蛋白质酶的必需物质（辅酶）。 根据人和细菌获 THF 途径不同设计磺胺类杀菌剂。叶酸（FA）结构见 P377，DHF（二氢叶酸）、THF 见 P457 图 11-30。 FA 还原酶 DHF 还原酶 叶酸 DHF THF （人可从食物中获取） DHF 合成酶 对氨基苯甲酸（细菌靠此合成 THF） 人体可直接从食物获取叶酸经 DHF 还原成 THF 而细菌只能从对氨基 苯甲酸合成 DHA。因此若抑制 DHF 合成酶，即可断绝细菌 THF 来源， 从而抑制核酸和蛋白质的合成，而抗菌。 THF 中对氨基苯甲酰胺部分的过渡态类似物对氨基苯磺酰胺可抑制 DHF 合成酶。 磺胺药抗菌谱广，性质稳定，对肺炎、痢疾等疗效显著。 此外抗癌药阿糖胞苷、氨甲喋呤等均为酶的竞争性抑制剂。 §2.10 温度、pH 等对酶反应影响 （一） 酶反应最适温度：使酶促反应速度达最大值的温度，见 P378 图 9-28， 一般为钟罩形曲线。 每种酶在一定条件下都有其最适温度，动物一般 35~400C，植物 40~500C， 微生物则差别较大，最高可达 700C。 （二）最适 pH：在此 pH 下酶促反应有最大速率。见 P379 图 9-29，钟罩形曲 线。 一般酶最适 pH 在 5~8 之间，动物 6.5~8.0，植物及微生物 4.5~6.5。 （三）激活剂：凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，大部分是无机离子或 简单有机化合物。 不同的酶可有不同激活剂