分子细胞遗传学
分子细胞遗传学
=日三日
原位杂交( In situ hybridization) 1)同位素原位杂交( Isotopic in situ hybridization) 70年代 2)非同位素原位杂交( Non-isotopic in situ hybridization) 80年代中后期 (1)免疫酶联 (2)荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization,FISH 六同位素原位杂交的不足之处: 1)不稳定; 2)低特异性; 3)高背景; 4)暴光时间长 5)结果统计学处理繁琐。 Lichter P. Cremert. Ward. c
原位杂交(In situ hybridization) 1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) ——70年代 2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) ——80年代中后期 （1）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH) **同位素原位杂交的不足之处： 1）不稳定； 2）低特异性； 3）高背景； 4）暴光时间长； 5）结果统计学处理繁琐。 Lichter P. Cremer T. Ward D.C
FISH: Fluorescent In Situ Hybridization) FISH is the detection of highly specific dna probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled with fluorescent(direct method)or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope
FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization). FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope
Fluorescence In-situ Hybridization (FISH) chromosome on microscope slide denature A helix F probe labelled with TAGATCCT hybridize probe to: denatured denature hromosome TAGAT CCT TAG ATCCT 个TT个平个个个个 ATC TA G A
Interphase Nucleus Metaphase chromosomes labeled with DNA probe (arrows) centromere of chromosome 1
读六荧光原位杂交的特点: 1)快速;2)信号强;3)特异性高;4)多色。 六六FISH有上述优点的原因 1)使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质:(1)生物素boin)地高辛( digoxigenin) 半抗原报告分子(间接标记) (2)荧光物质(直接标记) Cy2或 FluorO(绿色)/Cy3(橙色)/Cy35(猩红色)Cy5(红色)Aqua(兰色) 间接标记的信号检测(抗 biotin!或 digoxigenin抗体上连接荧光物质)物质: conjugated to avidin or antibody of digoxigenin (1) Fluorescein isothiocyanate((FITC或 Bidopy绿色 (2) Texas red, Rhodamine,红色 (3)AMCA—兰色 染色体复染的物质 Propidium lodide(PD)(红色),DAPI(兰色), quInacrine(绿色), chromomycin a3(绿色)
**荧光原位杂交的特点： 1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。 **FISH有上述优点的原因： 1）使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记） Cy2或FluorX(绿色) / Cy3(橙色) / Cy3.5(猩红色) / Cy5(红色) / Aqua(兰色) 间接标记的信号检测（抗biotin或digoxigenin抗体上连接荧光物质）物质： conjugated to avidin or antibody of digoxigenin (1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或Bidopy——绿色 (2)Texas Red, Rhodamine, ——红色 (3)AMCA——兰色 染色体复染的物质: Propidium Iodide (PI)（红色），DAPI（兰色），quinacrine（绿色）， chromomycine A3（绿色）
2)染色体“原位抑制”杂交( chromosome in situ suppression,CISS) 克服散在的重复序列造成的杂交背景,提高信号的特异性,在探针中加入过量 的未标记的竞争性 DNA(competitor DNA),如 human cot-1DNA,进行杂交前 的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性,而 特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少,绝大部分仍保持单链状态。 读FISH技术的应用 1)基因(或DNA片段)的染色体定位; 2)染色体数目与结构异常的检测; 3)间期细胞遗传学(绒毛羊水精子/卵裂球其它间期细胞研究与诊断) 4)肿瘤遗传学研究
2）染色体“原位抑制”杂交（chromosome in situ suppression, CISS) 克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量 的未标记的竞争性DNA(competitor DNA)，如human Cot-1 DNA，进行杂交前 的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而 特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。 **FISH技术的应用 1）基因（或DNA片段）的染色体定位； 2）染色体数目与结构异常的检测； 3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）； 4）肿瘤遗传学研究
用于FISH的探针 1)单拷贝探针: (1)种类:YAC,BAC, Cosmid, Plasmid,cDNA片段 (2)应用 (a)定位DNA片段及嵌合体克隆验证; (b)确定染色体微小缺失与重复; (c)染色体断裂点分析 (d)间期细胞染色体数目异常诊断
**用于FISH的探针 1）单拷贝探针： （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断