16肽:P162 肽为氨基酸的线性聚合物,蛋白质是由一条或多条多肽链构成。 (一)肽和肽键结构 肽的命名从N端开始到COOH端,氨基酸残基按顺序从左向右写 NH末端在左,COOH端在右。如 Ser-Gly-Phe,称为:丝氨酰甘氨酰苯 丙氨酸 般氨基酸数目20的肽为多肽 (二)肽的物理化学性质 (1)与氨基酸同,为离子晶格,熔点高,在水溶液中以偶极离子存在。多 肽中酰胺的氢不易解离,肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基 和a-羧基,以及侧链R基上的可解离基团,如Gu的γ-COOH、Iys 的ENH2 (2)滴定曲线:也有等电点,为多价离子等电点。以 Gly-Glu- Lys-Ala四 肽为例(P166表46) ①当pH102,ε+NH3解离,2个NH2、2个COO,净电荷 pH在等电点以上(碱性),多肽带负电荷。 pH在等电点以下(酸性),多肽带正电荷 蛋白质滴定曲线更加复杂 (3)化学反应 ①与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色,为α-NH2反应(注意:伯胺 也可使茚三酮显紫色),氨基酸、多肽均有此反应。Pro为仲胺(亚氨 基氨基酸),与茚三酮生成黄色物质。 茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽 ②肽键的双缩脲反应:多肽,蛋白质中有肽键,有此反应,氨基酸没 有此反应。双缩脲:H2N- CO-NH-CO-NH2,P163 双缩脲反应:含有两个或两个以上肽键的化合物(如双缩脲或二肽 以上等多肽)在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物, 可定性或定量测定蛋白质含量,颜色深浅与蛋白质浓度成正比 (三)活性多肽 动植物体内存在许多具有生理活性的多肽,多肽药物已获得人们的重视 肽:肌肽β-Ala-His,抗氧化,抗自由基,消炎,调节免疫, 甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH3,比蔗糖甜200倍。 三肽:谷胱甘肽YGlu- Cys-Gly,维持红细胞及其蛋白质中Cys的SH处 于还原态。 四肽:促胃酸激素。 五肽:脑啡肽,内源性吗啡,与吗啡受体结合
1.6 肽:P162 肽为氨基酸的线性聚合物,蛋白质是由一条或多条多肽链构成。 (一)肽和肽键结构 肽的命名从 N 端开始到 COOH 端,氨基酸残基按顺序从左向右写, -NH2 末端在左,-COOH 端在右。如 Ser-Gly-Phe,称为:丝氨酰甘氨酰苯 丙氨酸。 一般氨基酸数目20 的肽为多肽。 (二)肽的物理化学性质 (1) 与氨基酸同,为离子晶格,熔点高,在水溶液中以偶极离子存在。多 肽中酰胺的氢不易解离,肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基 和α-羧基,以及侧链 R 基上的可解离基团,如 Glu 的γ-COOH、Lys 的ε-NH2。 (2) 滴定曲线:也有等电点,为多价离子等电点。以 Gly-Glu-Lys-Ala 四 肽为例 (P166 表 4-6): ① 当 pH 10.2,ε- +NH3 解离,2 个 NH2、2 个 COO-,净电荷-2。 pH 在等电点以上(碱性),多肽带负电荷。 pH 在等电点以下(酸性),多肽带正电荷。 蛋白质滴定曲线更加复杂。 (3) 化学反应 ① 与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色,为α-NH2 反应(注意:伯胺 也可使茚三酮显紫色),氨基酸、多肽均有此反应。Pro 为仲胺(亚氨 基氨基酸),与茚三酮生成黄色物质。 茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。 ② 肽键的双缩脲反应:多肽,蛋白质中有肽键,有此反应,氨基酸没 有此反应。双缩脲:H2N-CO-NH-CO-NH2 ,P163。 双缩脲反应:含有两个或两个以上肽键的化合物(如双缩脲或二肽 以上等多肽)在碱性溶液中能与 CuSO4 生成紫红色或紫蓝色复合物, 可定性或定量测定蛋白质含量,颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 (三)活性多肽: 动植物体内存在许多具有生理活性的多肽,多肽药物已获得人们的重视。 二肽:肌肽 β-Ala-His,抗氧化,抗自由基,消炎,调节免疫。 甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH3,比蔗糖甜 200 倍。 三肽:谷胱甘肽 γ-Glu-Cys-Gly,维持红细胞及其蛋白质中 Cys 的-SH 处 于还原态。 四肽:促胃酸激素。 五肽:脑啡肽,内源性吗啡,与吗啡受体结合
蛋氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheMet 亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheLeu 八肽:α-鹅膏蕈碱,见P168图4-6,剧毒毒素。 九肽:牛催产素,牛加压素(升高血压),见P167,两者只差两个氨基酸, 但生理作用极不相同 十肽:短杆菌肽,见P532,为抗生素。 促黄体生成激素释放因子,见P551,为激素 十六肽:内啡肽,有镇痛作用。 二十四肽:促皮质素(ACTH),治关节炎,已商品化。 二十六肽:蜂素溶血肽,抗关节炎。 五十一肽:胰岛素,降血糖。 以活性多肽研究为基础的药物研究 血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(ACEI)的开发是近代高血压治疗史上 的重大进展。 人体内存在的血管紧张素I(AngI)为十肽,无活性,但在ACE作用下 转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅢ)为八肽,具有收缩血管平滑肌作用,使血压升高。 ACE DRVYIHPFHL(Ang I DRVYIHPF(AngI)。 ACEI可使ACE失活,使AngI不能形成AngI,从而降血压,研究Ang 如巯甲丙脯酸( Captopril)、依那普利(Empm)、赖诺普利( (Lisinopril)等。 17蛋白质一级结构测定:P168 测定蛋白质中共价键连接的全部情况,包括存在的链内、链间的二硫键位置, 氨基酸数目、类型和顺序 蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构,而三维结构决定其生物活性和功能。蛋 白质中氨基酸顺序是由基因决定的,是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的 桥梁。 蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史,具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基 酸顺序。如细胞色素C(P182),是一种含血红素的电子转运蛋白,存在于所有 真核生物的线粒体中。40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示,在细胞色素 C中含有的一百多个氨基酸残基,其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的 (P182图4-16),这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要,由此 可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树(P183图417)。来自任两个物 种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远 (一)蛋白质测序 样品纯度应>97%,测分子量(允许误差10%) 蛋白质分子中多肽链的数目:测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋 白要用变性剂将亚基拆开。 2.每一多肽链氨基酸组成:鉴定N-末端残基和C-末端残基,定出氨基酸序 列参考点。 3.按专一方式断裂成较小的肽片段:可用酶或化学方法完成,并用多种断 裂方法,将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段
蛋氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheMet。 亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheLeu。 八肽:α-鹅膏蕈碱,见 P168 图 4-6,剧毒毒素。 九肽:牛催产素,牛加压素(升高血压),见 P167,两者只差两个氨基酸, 但生理作用极不相同。 十肽:短杆菌肽,见 P532,为抗生素。 促黄体生成激素释放因子,见 P551,为激素。 十六肽:内啡肽,有镇痛作用。 二十四肽:促皮质素(ACTH),治关节炎,已商品化。 二十六肽:蜂素溶血肽,抗关节炎。 五十一肽:胰岛素,降血糖。 以活性多肽研究为基础的药物研究: 血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(ACEI)的开发是近代高血压治疗史上 的重大进展。 人体内存在的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)为十肽,无活性,但在 ACE 作用下 转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为八肽,具有收缩血管平滑肌作用,使血压升高。 ACE DRVYIHPFHL(AngⅠ) DRVYIHPF(AngⅡ)。 ACEI 可使 ACE 失活,使 AngⅠ不能形成 AngⅡ,从而降血压,研究 Ang Ⅰ活性部位,作用机理,进而设计并合成 ACEI,已开发出二十多种降压药物, 如巯甲丙脯酸(Captopril)、依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Lisonopril)等。 1.7 蛋白质一级结构测定 :P168 测定蛋白质中共价键连接的全部情况,包括存在的链内、链间的二硫键位置, 氨基酸数目、类型和顺序。 蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构,而三维结构决定其生物活性和功能。蛋 白质中氨基酸顺序是由基因决定的,是联系 DNA 遗传信息和蛋白质生物功能的 桥梁。 蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史,具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基 酸顺序。如细胞色素 C(P182),是一种含血红素的电子转运蛋白,存在于所有 真核生物的线粒体中。40 多种物种的细胞色素 C 序列的研究揭示,在细胞色素 C 中含有的一百多个氨基酸残基,其中有 28 个位置上的氨基酸残基是相同的 (P182 图 4-16),这些不变残基对于细胞色素 C 的生物学功能至关重要,由此 可根据细胞色素 C 序列的物种差异建立进化树(P183 图 4-17)。来自任两个物 种的细胞色素 C 间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。 (一)蛋白质测序 样品纯度应>97%,测分子量(允许误差 10%)。 1. 蛋白质分子中多肽链的数目:测 N-末端和 C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋 白要用变性剂将亚基拆开。 2. 每一多肽链氨基酸组成:鉴定 N-末端残基和 C-末端残基,定出氨基酸序 列参考点。 3. 按专一方式断裂成较小的肽片段:可用酶或化学方法完成,并用多种断 裂方法,将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段
4.侧各肽段氨基酸序列:常用 Edman降解法,用自动序列分析仪。 5.测定片段次序:用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。 6.确定二硫键位置。 (二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 (1)N-末端分析 ①二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法: Sanger反应 2、4-二硝基氟苯称为 Sanger试剂,与游离末端氨基反应生成DNP多 肽或DNP-蛋白质,再酸性水解生成DNP氨基酸(黄色),提取分离后可 进行鉴定和定量测定 此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 ②丹磺酰氯(DNS)法:有荧光,灵敏度髙。5-二甲氨基萘-1-磺酰氯(DNS 结构式见170。 ③Eman降解 苯异硫氰酸酯(PITC)法: Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的 N-端将氨基酸残基一个个切下来,还可用来测定氨基酸序列。 PITC与多肽链每反应一次,得到一个PIH-氨基酸和少一个氨基酸残 基的肽。 ,PIH( phenylthiohydantoin):苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用TC或 C快速测定,由此发展出氨基酸序列自动分析仪 氨肽酶法 用外切酶,从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶,适用于 N-末端残基的氨基酸被封闭的肽(如环肽);N-末端是焦谷氨酸残基时, 可使用焦谷氨酸氨肽酶 (2)C-末端分析 ①肼解法:蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应,除C-末端氨基酸以 游离形式存在外,其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键 而不易与-COOH反应,肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。 ②还原法:用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇,肽水解后可分离、鉴定。 ③羧肽酶法:专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放岀游离氨基酸,P17l 图4-7。 (三)二硫键断裂 用变性剂,如8moL尿素或6mol盐酸胍使蛋白质变性,分子内部-SS 露出,并用 HSCH2CH2OH处理,则-S-S-变成2个SH,再用碘乙醇保护 -SH不被氧化,P172图4-8。 也可用过甲酸氧化,将S-S-变成2个磺酸基。 (四)氨基酸组成分析 可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解(6 MolL HCl),再 用碱水解测Trpo 测出Asx和GIx,酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出 P172表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成 (五)多肽链部分裂解成小肽段,分别测序 现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段,需将蛋白质先裂解成较小肽 段,分离后测序。 (1)酶裂解法:常用的蛋白酶有以下几种(为内切酶)
4. 侧各肽段氨基酸序列:常用 Edman 降解法,用自动序列分析仪。 5. 测定片段次序:用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。 6. 确定二硫键位置。 (二)N-末端和 C-末端氨基酸残基的鉴定 (1)N-末端分析 ① 二硝基氟苯(DNFB 或 FDNB)法:Sanger 反应。 2、4-二硝基氟苯称为 Sanger 试剂,与游离末端氨基反应生成 DNP-多 肽或 DNP-蛋白质,再酸性水解生成 DNP-氨基酸(黄色),提取分离后可 进行鉴定和定量测定。 此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 ② 丹磺酰氯(DNS)法:有荧光,灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯(DNS), 结构式见 170。 ③ Eman 降解 苯异硫氰酸酯 (PITC) 法:Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的 N-端将氨基酸残基一个个切下来,还可用来测定氨基酸序列。 PITC 与多肽链每反应一次,得到一个 PTH-氨基酸和少一个氨基酸残 基的肽。 PTH (phenylthiohydantoin): 苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用 TLC 或 HPLC 快速测定,由此发展出氨基酸序列自动分析仪。 ④ 氨肽酶法: 用外切酶,从 N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶,适用于 N-末端残基的氨基酸被封闭的肽(如环肽);N-末端是焦谷氨酸残基时, 可使用焦谷氨酸氨肽酶。 (2)C-末端分析 ① 肼解法:蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应,除 C-末端氨基酸以 游离形式存在外,其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键 而不易与-COOH 反应,肼解中 Gln、Asn、Cys 被破坏。 ② 还原法:用 LiBH4 还原 C-末端氨基酸成氨基醇,肽水解后可分离、鉴定。 ③ 羧肽酶法:专一地从肽链 C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸,P171 图 4-7。 (三)二硫键断裂: 用变性剂,如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性,分子内部-S-S- 露出,并用 HSCH2CH2OH 处理,则-S-S-变成 2 个-SH,再用碘乙醇保护 -SH 不被氧化,P172 图 4-8。 也可用过甲酸氧化,将-S-S-变成 2 个磺酸基。 (四)氨基酸组成分析: 可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解(6mol/L HCl),再 用碱水解测 Trp。 测出 Asx 和 Glx,酰胺基总量由水解液中 NH4Cl 量计算出。 P172 表 4-8 列出一些蛋白质的氨基酸组成。 (五)多肽链部分裂解成小肽段,分别测序: 现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段,需将蛋白质先裂解成较小肽 段,分离后测序。 (1) 酶裂解法:常用的蛋白酶有以下几种(为内切酶):
胰蛋白酶:水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键,如Lys,Arg 糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶):肽键羧基端为芳香族氨基酸,如Phe Tp、或Tyr,以及疏水氨基酸Leu、Met或His 胃蛋白酶:特异性不太强,切点多,肽键羧基端为芳香族和疏水氨 基酸。 (2)化学裂解法:溴化氰BCN断裂羧基端为Met的肽键,反应见P175图 4-10,生成肽酰高丝氨酸。 (六)肽段氨基酸序列测定 (1) Edman化学降解法: 每反应一次生成一个PTH-AA,层析分离、鉴定,剩下减少一个残 基的肽链,又有新N端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分 析,进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅5pmol。 Edman降解现已有多种改进。如 DNS-Edman测序,可提髙灵敏度 试剂的改进,用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏 (2)质谱法:电喷射电离(ESI),见P178图4-11。使蛋白质离子解吸进 入气相,15肽以下均可用。 (七)肽段在多肽链中次序确定 用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段,由于切 口错位,可由重迭肽(两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段)确定肽段先 后次序,从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179图4-12 (八)二硫桥位置的确定 用切点多的胃蛋白酶水解肽链,生成比较小的含二硫桥的肽段混合 物,将样品点在滤纸中央,在pH65进行第一向电泳分离。然后用过甲酸 蒸气熏,-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸(带负电荷)的肽。将滤纸 转90°,在完全相同条件下再进行第二向电泳,大多数肽段迁移率未变, 位于滤纸对角线上,而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线 (向正极向),见P178图4-13。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下, 进行氨基酸序列分析,推出二硫桥的位置(肽链内或肽链间)。 现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的,但 仍需氨基酸序列分析配合
胰蛋白酶:水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键,如 Lys,Arg。 糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶):肽键羧基端为芳香族氨基酸,如 Phe、 Trp、或 Tyr,以及疏水氨基酸 Leu、Met 或 His。 胃蛋白酶:特异性不太强,切点多,肽键羧基端为芳香族和疏水氨 基酸。 (2) 化学裂解法:溴化氰 BrCN 断裂羧基端为 Met 的肽键,反应见 P175 图 4-10,生成肽酰高丝氨酸。 (六)肽段氨基酸序列测定 (1) Edman 化学降解法: 每反应一次生成一个 PTH-AA,层析分离、鉴定,剩下减少一个残 基的肽链,又有新 N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分 析,进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅 5 pmol。 Edman 降解现已有多种改进。如 DNS-Edman 测序,可提高灵敏度; 试剂的改进,用由荧光基团或有色基团标记的 PITC 可更灵敏。 (2) 质谱法:电喷射电离(ESI),见 P178 图 4-11。使蛋白质离子解吸进 入气相,15 肽以下均可用。 (七)肽段在多肽链中次序确定 用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段,由于切 口错位,可由重迭肽(两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段)确定肽段先 后次序,从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179 图 4-12。 (八)二硫桥位置的确定 用切点多的胃蛋白酶水解肽链,生成比较小的含二硫桥的肽段混合 物,将样品点在滤纸中央,在 pH6.5 进行第一向电泳分离。然后用过甲酸 蒸气熏,-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸(带负电荷)的肽。将滤纸 转 90 0,在完全相同条件下再进行第二向电泳,大多数肽段迁移率未变, 位于滤纸对角线上,而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线 (向正极向),见 P178 图 4-13。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下, 进行氨基酸序列分析,推出二硫桥的位置(肽链内或肽链间)。 现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的,但 仍需氨基酸序列分析配合