2.1酶的作用机制P38410章 (一)酶的活性部位 (1)酶活性部位:酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域,活性部位 又称活性中心。 酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心,分为: ①结合部位:负责与底物结合,决定酶的专一性 ②催化部位:负责催化底物键的断裂或形成,决定酶的催化能力。 对需要辅酶的酶,辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位 组成部分 (2)酶活性部位特点: 1.活性部位只占酶分子中相当小的部分,通常1~2%。P384表10-1列举 些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共129个氨基酸残基,活性部位 为Asps和Glu3s;胰凝乳蛋白酶241个残基,活性部位为His5,Aspo2,Ser 2.活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚 远,甚至不在一条肽链上,但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶 即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。 3.酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中,相互构象发生一定 变化后才互补。如P385图10-1。 4.活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境, 也含有某些极性氨基酸残基有利于催化,底物在此裂缝内有效浓度很髙。 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键:氢键、盐键、范德华力和 疏水相互作用。 6.酶活性部位具有柔性和可运动性。 (二)研究酶活性部位的方法 (1)酶侧链基团化学修饰法 1.特异性共价修饰:如二异丙基磷酰氟(DFP)专一地与酶活性部位 Ser-OH的羟基共价结合,使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共28个Ser,但DFP 只与活性中心的Ser反应,见P386。反应后,用HCl将酶部分水解,得含二 异丙基磷酸酯(DIP)基团的肽的片断,序列分析定出 DIP-Ser为 Ser195。 2.亲和标记:用与底物结构相似的修饰剂,对酶活性部位进行专一性共 价修饰 如TPCK(结构式见P387),结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L 苯丙氨酸乙酯(TPE)类似,TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His5结合,说明Hiss 为该酶活性部位的一个氨基酸残基 (2)X射线晶体结构分析: 可提供酶分子三维结构,了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状 态,与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况,被作用键周围残 基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式 如溶菌酶:对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团 为Gus和Asp2 又如胰凝乳蛋白酶经ⅹ-射线晶体结构分析,表明活性部位由Sers、His 和Asp组成,并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”, 如P409图10-40所示:①没有底物时,His未质子化,三联体排列为A
2.11 酶的作用机制 P384 10 章 （一）酶的活性部位 （1）酶活性部位：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，活性部位 又称活性中心。 酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心，分为： ① 结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性。 ② 催化部位：负责催化底物键的断裂或形成，决定酶的催化能力。 对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位 组成部分。 （2）酶活性部位特点： 1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分，通常 1~2%。P384 表 10-1 列举 一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共 129 个氨基酸残基，活性部位 为 Asp52 和 Glu35；胰凝乳蛋白酶 241 个残基，活性部位为 His57，Asp102，Ser 195。 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚 远，甚至不在一条肽链上，但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶 即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。 3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中，相互构象发生一定 变化后才互补。如 P385 图 10-1。 4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境， 也含有某些极性氨基酸残基有利于催化，底物在此裂缝内有效浓度很高。 5. 酶与底物结合形成 ES 复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和 疏水相互作用。 6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。 （二）研究酶活性部位的方法 （1） 酶侧链基团化学修饰法： 1. 特异性共价修饰：如二异丙基磷酰氟（DFP）专一地与酶活性部位 Ser-OH 的羟基共价结合，使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共 28 个 Ser，但 DFP 只与活性中心的 Ser 反应，见 P386。反应后，用 HCl 将酶部分水解，得含二 异丙基磷酸酯（DIP）基团的肽的片断，序列分析定出 DIP-Ser 为 Ser195。 2. 亲和标记：用与底物结构相似的修饰剂，对酶活性部位进行专一性共 价修饰。 如 TPCK（结构式见 P387），结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L- 苯丙氨酸乙酯（TPE）类似，TPCK 只与胰凝乳蛋白酶中 His57 结合，说明 His57 为该酶活性部位的一个氨基酸残基。 （2） X-射线晶体结构分析： 可提供酶分子三维结构，了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状 态，与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况，被作用键周围残 基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。 如溶菌酶：对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团 为 Glu35 和 Asp52。 又如胰凝乳蛋白酶经 X-射线晶体结构分析，表明活性部位由 Ser195、His57 和 Asp102 组成，并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”， 如 P409 图 10-40 所示： ① 没有底物时，His57 未质子化，三联体排列为 A；
②在加上底物后,Serσs转移一个质子给His,带正电荷的咪唑环通过带负 电荷的Asp静电相互作用被稳定,成为B。详细酶作用机制见P410图 10-42 (三)影响酶催化效率的有关因素: (1)底物和酶的邻近效应与定向效应 酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。 邻近效应:底物与酶先形成中间体络合物,两分子成一个分子,分子内 反应速度比分子间反应速度提高。P388图10-2所示:用咪唑催化乙酸对硝 基苯酯水解来证实:咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基 苯酚;若将咪唑分子先共价连接在底物上,在分子内催化酯键水解,可增速 24倍。 定向效应:底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表10-3用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明:分子内催化反 应,当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向,反应速度愈大。每移去 个旋转自由度,反应速度约增加200倍。 又如P389所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明:当在分子 中引入甲基使羧基和酚羟基定位,反应速率可提高2.5×1011倍。 (2)底物的形变和诱导契合: 酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低,产生“电 子张力”,底物扭曲而接近过渡态,使反应加速。 如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯(P390),由于构象更接近磷酸酯水 解时的过渡态,P-O键有电子张力,因此水解速度是磷酸二甲酯的108倍。 溶菌酶作用细菌细胞壁,水解由N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶 菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式,可加速水解 (3)酸碱催化 酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团,又是一个有效的广义 酸碱催化功能基团,因此蛋白质中His含量虽少,但却占有重要的地位。此 外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等,都具有广义酸碱催化功能。 (4)共价催化 有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物,P392表10-5列 出形成共价中间物的一些酶。 酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等,可进 攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。 (5)金属离子催化 几乎三分之一的酶催化需要金属离子,金属离子可以与酶紧密结合,也 可以是松散结合。 ①金属作用与H相似,但由于带正电荷更多而作用更强,且容易维持 定浓度。②金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。如Mg艹屏蔽ATP中 磷酸基负电荷,消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应,此时激酶真正作用 底物是Mg2+-ATP,而不是ATP,见P394。③金属离子通过水的离子化,使 水分子更具酸性,促进亲核催化。④许多氧化还原酶都含有金属的辅基。 (6)多元催化和协同效应: 酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活 性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”’,催化肽键水解:核糖核酸酶
② 在加上底物后，Ser195 转移一个质子给 His57，带正电荷的咪唑环通过带负 电荷的 Asp102 静电相互作用被稳定，成为 B。详细酶作用机制见 P410 图 10-42。 （三）影响酶催化效率的有关因素： （1） 底物和酶的邻近效应与定向效应。 酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。 邻近效应：底物与酶先形成中间体络合物，两分子成一个分子，分子内 反应速度比分子间反应速度提高。P388 图 10-2 所示：用咪唑催化乙酸对硝 基苯酯水解来证实：咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基 苯酚；若将咪唑分子先共价连接在底物上，在分子内催化酯键水解，可增速 24 倍。 定向效应：底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表 10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明：分子内催化反 应，当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向，反应速度愈大。每移去一 个旋转自由度，反应速度约增加 200 倍。 又如 P389 所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明：当在分子 中引入甲基使羧基和酚羟基定位，反应速率可提高 2.5×1011 倍。 （2） 底物的形变和诱导契合： 酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电 子张力”，底物扭曲而接近过渡态，使反应加速。 如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯（P390），由于构象更接近磷酸酯水 解时的过渡态，P-O 键有电子张力，因此水解速度是磷酸二甲酯的 108 倍。 溶菌酶作用细菌细胞壁，水解由 N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶 菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式，可加速水解。 （3） 酸碱催化： 酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团，又是一个有效的广义 酸碱催化功能基团，因此蛋白质中 His 含量虽少，但却占有重要的地位。此 外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等，都具有广义酸碱催化功能。 （4） 共价催化： 有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物，P392 表 10-5 列 出形成共价中间物的一些酶。 酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等，可进 攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。 （5） 金属离子催化： 几乎三分之一的酶催化需要金属离子，金属离子可以与酶紧密结合，也 可以是松散结合。 ① 金属作用与 H+相似，但由于带正电荷更多而作用更强，且容易维持一 定浓度。② 金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。如 Mg++屏蔽 ATP 中 磷酸基负电荷，消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应，此时激酶真正作用 底物是 Mg2+ -ATP，而不是 ATP，见 P394。③ 金属离子通过水的离子化，使 水分子更具酸性，促进亲核催化。④ 许多氧化还原酶都含有金属的辅基。 （6） 多元催化和协同效应： 酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活 性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”，催化肽键水解；核糖核酸酶
催化水解时,His12起广义碱催化作用,接受一个质子,而Hisg起广义酸作 用,和磷酸的氧原子形成氢键 亚胺内酯水解:在咪唑缓冲液中得酰胺,而在磷酸缓冲液中,尽管pH 相同产物却为胺和酯,其区别即为磷酸盐双功能催化 (7)微环境影响 酶促反应在酶表面的疏水裂缝(活性中心)中进行,如同反应在有机溶 剂中进行,反应基团不为溶剂化,亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu3s 的羧基在非极性区,催化功能増速3×106倍。模拟酶由此设计胶束模拟酶和 环糊精等。 (四)酶催化反应机制实例: 溶菌酶( Lysozyme,EC3.2..7)是第一个用X-行射阐明结构和功能的 酶。生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解,结构如P395图10-9所示。 细胞壁是由NAG(N-乙酰氨基葡萄糖)和NAM(N-乙酰氨基葡萄糖乳酸) 通过β(1→4)糖蔗键交替排列而成的多糖。溶菌酶底物为NAG-NAM交替 的六糖,可表示为 ABCDEF (1)在酶活性部位凹穴中,底物受酶影响D-环发生变形,糖环构象从 椅式变成能量较高的半椅式或船式,接近过渡态构象 (2)酶活性基团处于非极性区的Glus的羧基不解离,提供一个H到D 环与E环间的糖苷键上氧原子上,D环上的C1与氧原子间的糖苷键断开,形 成正碳离子(SP2)过渡态中间物,并为处于极性区的活性基团Asps2上的羧 基负离子所稳定。六糖中的E及F两糖残基成HOEF离开,如P398图10-16 所示 (3)正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的OH反应,解除SP2张力 ABCD四糖残基离开酶分子,Glu3s同时质子化恢复原状。如P399图10-17 所示 (4)至次一次反应完成,细胞壁打开一个缺口
催化水解时，His12 起广义碱催化作用，接受一个质子，而 His119 起广义酸作 用，和磷酸的氧原子形成氢键。 亚胺内酯水解：在咪唑缓冲液中得酰胺，而在磷酸缓冲液中，尽管 pH 相同产物却为胺和酯，其区别即为磷酸盐双功能催化。 （7） 微环境影响： 酶促反应在酶表面的疏水裂缝（活性中心）中进行，如同反应在有机溶 剂中进行，反应基团不为溶剂化，亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶 Glu35 的羧基在非极性区，催化功能增速 3×106 倍。模拟酶由此设计胶束模拟酶和 环糊精等。 （四）酶催化反应机制实例： 溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是第一个用 X-衍射阐明结构和功能的 酶。生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解，结构如 P395 图 10-9 所示。 细胞壁是由 NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）和 NAM（N-乙酰氨基葡萄糖乳酸） 通过β（1→4）糖蔗键交替排列而成的多糖。溶菌酶底物为 NAG-NAM 交替 的六糖，可表示为 ABCDEF。 （1） 在酶活性部位凹穴中，底物受酶影响 D-环发生变形，糖环构象从 椅式变成能量较高的半椅式或船式，接近过渡态构象。 （2） 酶活性基团处于非极性区的 Glu35 的羧基不解离，提供一个 H+到 D 环与 E 环间的糖苷键上氧原子上，D 环上的 C1 与氧原子间的糖苷键断开，形 成正碳离子（SP2）过渡态中间物，并为处于极性区的活性基团 Asp52 上的羧 基负离子所稳定。六糖中的 E 及 F 两糖残基成 HO-EF 离开，如 P398 图 10-16 所示。 （3） 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的-OH 反应，解除SP2张力， ABCD 四糖残基离开酶分子，Glu35 同时质子化恢复原状。如 P399 图 10-17 所示。 （4） 至次一次反应完成，细胞壁打开一个缺口