其他未结合物质 3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检 验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对 受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清， 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上 不同决定簇的单抗，分别用于包被周相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性， 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而 不再形成”夹心复合物”。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于 抗原过剩带上)与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4）， 如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准 曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用 一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中BsAg、AFP和尿液hGG等）时，应注意 可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如BsAg的a决定簇，也可用针对此决定 的同一单抗分别包被周相和制备南结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，BsAg有adr、ad、 ayr、a4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的 问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(F)的干扰。F是一种自身抗体，多为Ig型， 能和多种动物IgG的FC段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R℉，它可充当抗原成 份，同时与固相抗体和醇标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F(b')或Fab片段作酶结合物的 试剂，由于去除了FC段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，己被列 为这类试剂的一项考核指标（参见6.2） 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原 因其不能形成两位点夹心。 2.2.2双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间 接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定， 其他未结合物质。 3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检 验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对 受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清， 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上 不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性， 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而 不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于 抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见 1.3.2，图 1-4）， 如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准 曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用 一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时，应注意 可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可用针对此决定 的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBsAg 有 adr、adw、 ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的 问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为 IgM 型， 能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成 份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F（ab'）或 Fab 片段作酶结合物的 试剂，由于去除了 Fc 段，从而消除 RF 的干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列 为这类试剂的一项考核指标（参见 6.2）。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原， 因其不能形成两位点夹心。 2.2.2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间 接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定