实验四蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964)和 Davis(1964)设计的,样品和 浓缩胶中含 Tris-HC(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris甘氨酸(pH8.3),分离胶中含 Tris-HCl(pH88)。系统中所有组分都含有0.1%的SDs( Laemmli,1970)。样品和浓缩胶中的 氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是 电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH值较高,有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子 之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区 带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性 质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形状的长椭园棒,不同蛋白质的SDS复合 物的短轴长度都一样(约为18A,即1.8mm),而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这 样的SDS-蛋白质复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响, 而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于SDS和巯基乙醇的作用,蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链,因此 测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离筢围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰胺交联后凝 胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的 孔径随“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”比率的增加而变小,比率接近1:20时孔径达到最小值。 SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”为1:29配制,试验表明它能分离 大小相差只有3%的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓 度的函数。用5~15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表:188 实验四 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和 浓缩胶 中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含 Tris- 甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的 氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是 一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH 值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子 之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和 pH 值均匀的区 带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性 质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合 物的短轴长度都一样（约为 18Å，即 1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这 样的 SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响， 而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于 SDS 和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此 测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝 胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成 SDS 蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的 孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为 1：29 配制，试验表明它能分离 大小相差只有 3% 的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓 度的函数。用 5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：