高透明质酸生产效率,为工业化生产打下基础;最后对Sz0 epidemicus的代谢网络进行了分 析,根据理论计算结果,采用营养增强型培养基,实现透明质酸的高效生产。具体内容如下 1.以兽疫链球菌( Streptococcus zooepidemicus)H23为生产菌株,采用无血清、无BH(心 脑浸液)种子培养基及较为简单的发酵培养基,进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上,采用小型发酵罐进行S.〓00 epidemicus H23培养的研究,并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析,扩展功能单元理论,提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型,为补料培养及其优化控制提供理论基础 2.采用模拟体系,对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究,建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下,考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响,从流变学角度 探讨发酵机制,为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础,对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析,探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理,提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3.根据分批发酵动力学模型,对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论 以透明质酸最大产量为目标,对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究,并以最大生产强度为目标硏究多种模式的组合操作的可行性,优化操 作过程,为工业化生产打下了基础。 4.采用代谢网络分析方法对 S. Zooepidemicus代谢网络通量进行研究,建立不同发酵条件 下的代谢网络模型,确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性,并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础,通过实验确定S.〓0 epidemicus H23合成透明质酸的关键因子,并采用营养增强型培养基培养S.〓 zooepidemicus H23,减轻透 明质酸合成途径的抑制,提高透明质酸产量和对底物的转化率 第二节透明质酸摇瓶发酵条件的研究 、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物,以多糖为主要成分。1937年, Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜,其 后,又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜,使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌,已报道的有多种溶血性链球菌(A型)、兽疫链球菌C型)、马链球菌(C型)、粪马链球 菌(C型)、缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等。其中A型为人体致病菌,C型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸,并且在1983年,日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法,但由于其具有巨大的商业价值,除专利 外,关于发酵法生产透明质酸的报道并不多 微生物的培养条件,对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长,而且可以提高微生物对底物的利用能力,使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus对营养要求极为苛刻,已有的报道都表明,对其进行培养需要 以血清或BH( Brain heart Infusion)为培养基主要成分,特别是在种子培养阶段。为此,本节以 株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23为研究菌株,首先对种子培养基组成进 行了考察硏究,得到了无血清种子培养基;以此为基础采用摇瓶发酵的方式,对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究,得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件。 77 高透明质酸生产效率，为工业化生产打下基础；最后对 S. zooepidemicus 的代谢网络进行了分 析，根据理论计算结果，采用营养增强型培养基，实现透明质酸的高效生产。具体内容如下∶ 1．以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus) H23 为生产菌株，采用无血清、无 BHI(心 脑浸液)的种子培养基及较为简单的发酵培养基，进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上，采用小型发酵罐进行 S. zooepidemicus H23 培养的研究，并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析，扩展功能单元理论，提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型，为补料培养及其优化控制提供理论基础。 2．采用模拟体系，对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究，建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下，考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响，从流变学角度 探讨发酵机制，为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础，对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析，探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理，提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3．根据分批发酵动力学模型，对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论， 以透明质酸最大产量为目标，对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究，并以最大生产强度为目标研究多种模式的组合操作的可行性，优化操 作过程，为工业化生产打下了基础。 4．采用代谢网络分析方法对 S. zooepidemicus 代谢网络通量进行研究，建立不同发酵条件 下的代谢网络模型，确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性，并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础，通过实验确定 S. zooepidemicus H23 合成透明质酸的关键因子，并采用营养增强型培养基培养 S. zooepidemicus H23，减轻透 明质酸合成途径的抑制，提高透明质酸产量和对底物的转化率。 第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究 一、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物，以多糖为主要成分。1937 年，Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜，其 后，又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的 C 型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌，已报道的有多种溶血性链球菌(A 型)、兽疫链球菌(C 型)、马链球菌(C 型)、粪马链球 菌(C 型)、缺乳链球菌(C 型)以及鸡霍乱杆菌(C 型)等。其中 A 型为人体致病菌，C 型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸，并且在 1983 年，日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法，但由于其具有巨大的商业价值，除专利 外，关于发酵法生产透明质酸的报道并不多。 微生物的培养条件，对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus 对营养要求极为苛刻，已有的报道都表明，对其进行培养需要 以血清或 BHI(Brain Heart Infusion)为培养基主要成分，特别是在种子培养阶段。为此，本节以 一株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23 为研究菌株，首先对种子培养基组成进 行了考察研究，得到了无血清种子培养基；以此为基础采用摇瓶发酵的方式，对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究，得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件