3.研钵 4.大玻璃漏斗 5.小塑料桶 6.布氏漏斗 7.抽滤瓶 8.纱布 9.恒温水浴 10.紫外分光光度计 11.秒表 12.pH试纸 (二)试剂 1.pH4~4.5乙酸酸化水 2.2.5MH2SO4 3. 5M NaOH 4.硫酸铵 5.氯化钙 6. 2M NaOH 7.0.8M,pH0硼酸缓冲液:取20ml0.8M硼酸溶液,加8ml0.2M四硼酸钠溶液, 混合后,用pH计检查校正 8.0.4MpH9.0硼酸缓冲液(用“7”稀释1倍即可) 9.0.2MpH8.0硼酸缓冲液:取πoml0.2M硼酸溶液,加30ml0.5M四硼酸钠溶液, 混合后,用pH计校正。 10. 2M HCI 11. 00IMHCI 12.BAEE-015MpH8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含011毫克BAEE 和222毫克的氯化钙) 四、实验步骤 1.猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏10公斤(新鲜的或杀后立即冷藏的),除去脂肪和结缔组织后,绞碎,加入 2倍体积予冷的乙酸酸化水(pH40~4.5)于10~15℃搅拌提取24小时,四层纱布过滤 得乳白色滤液,用25MHSO4调p至2.5~3.0,放置3~4小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液(约1.5升),加入固体硫酸铵(予先硏细),使溶液达0.75饱和度(每升 滤液加492克)放置过夜后抽滤(挤压干),滤饼分次加入10倍体积(按饼重计)冷的 蒸馏水,使滤饼溶解,得胰蛋白酶原溶液,取样0.5m后进行活化:慢慢加入研细的固 体无水氯化钙(滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计)使Ca2+与SO42结合后,溶 液中仍含有0 IM Cacl2,边加边搅拌,用5 MNaOH调pH至80,加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌,于室温下活化8~10小时,(2~3小时取样一次,并用0.00MHCl稀释 测定酶活性增加的情况。活化完成(比活约3500~4000BAEE单位)后,用25MH2SO4 调pH至2.5~3.0,抽滤除去CaSO沉淀,弃去滤饼,滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋 245245 3. 研钵 4. 大玻璃漏斗 5. 小塑料桶 6. 布氏漏斗 7. 抽滤瓶 8. 纱布 9. 恒温水浴 10. 紫外分光光度计 11. 秒表 12. pH 试纸 （二）试剂 1. pH4～4.5 乙酸酸化水 2. 2.5M H2SO4 3. 5M NaOH 4. 硫酸铵 5. 氯化钙 6. 2M NaOH 7. 0.8M，pH9.0 硼酸缓冲液：取 20ml 0.8M 硼酸溶液，加 80ml 0.2M 四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计检查校正。 8. 0.4M pH9.0 硼酸缓冲液（用“7”稀释 1 倍即可） 9. 0.2M pH8.0 硼酸缓冲液：取 70ml 0.2M 硼酸溶液，加 30ml 0.5M 四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计校正。 10. 2M HCl 11. 0.01M HCl 12. BAEE－0.15M pH8.0Tris－HCl 缓冲液（每毫升 Tris 缓冲液含 0.11 毫克 BAEE 和 2.22 毫克的氯化钙） 四、实验步骤 1. 猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏 1.0 公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入 2 倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于 10～15℃搅拌提取 24 小时，四层纱布过滤 得乳白色滤液，用 2.5M H2SO4 调 pH 至 2.5～3.0，放置 3～4 小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液（约 1.5 升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达 0.75 饱和度（每升 滤液加 492 克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入 10 倍体积（按饼重计）冷的 蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液，取样 0.5ml 后进行活化：慢慢加入研细的固 体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使 Ca2+与 SO4 2-结合后，溶 液中仍含有 0.1M CaCl2，边加边搅拌，用 5M NaOH 调 pH 至 8.0，加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌，于室温下 活化 8～10 小时，（2～3 小时取样一次，并用 0.001M HCl 稀释）， 测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约 3500～4000BAEE 单位）后，用 2.5M H2SO4 调 pH 至 2.5～3.0，抽滤除去 CaSO4 沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋