实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 、实验目的 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法 2.学习用紫外法测定酶活性,搞清酶活性与比活性的概念。 、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2+的存在下,被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失 去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶 胰蛋白酶原的分子量约为24000,其等电点约为pH89,胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近(23300),其等电点约为pH0.8,最适pH76~8.0,在pH=3时最稳定,低于此 pH时,胰蛋白酶易变性,在pH>5时易自溶。Ca2离子对胰蛋白酶有稳定作用 重金属离子,有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基(如土豆、白薯、芋 头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键,其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为:酯键>酰胺键>肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(简称BAPA) 和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺(简称BANA)测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯(简称BAEE)和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(简称TAME)测定酯酶活力。本实验以 BAEE为底物,用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时,一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来,然后再根据等电点沉淀的原理,调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质, 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析岀。 经溶解后,以极少量活性胰蛋白酶激活,使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活),被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分,并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2~3 次结晶后,可获得相当纯的胰蛋白酶,其比活力可达到 8000~10000BAEE单位毫克蛋白,或更高 如需制备更纯的制剂,可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化 、番材与试剂 (一)器材 1.新鲜或冰冻猪胰脏 2.食品加工机和高速分散器244 实验十 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 一、实验目的 1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。 2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。 二、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在 Ca2+的存在下，被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链 N 端 赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失 去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原的分子量约为 24000，其等电点约为 pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近（23300），其等电点约为 pH10.8，最适 pH7.6～8.0，在 pH=3 时最稳定，低于此 pH 时，胰蛋白酶易变性，在 pH>5 时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。 重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋 头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为：酯键 > 酰胺键 > 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称 BAPA） 和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称 BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯（简称 BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称 TAME）测定酯酶活力。本实验以 BAEE 为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异。 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节 pH 以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质， 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。 经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过 2～3 次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 8000～10000BAEE 单位/毫克蛋白，或更高。 如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。 三、器材与试剂 （一）器材 1. 新鲜或冰冻猪胰脏 2. 食品加工机和高速分散器