实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶 引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的 手段,比起早期采用的盐析法,有机溶剂及等电点沉淀法等,分离效果要好得多。但是, 这些方法中,或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不 同,或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话,多是利用生物分子间物理和化学性 质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低,加之待分离物质之间的物 化性质差异较小,常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定 的纯度。这样既费时间,又费试剂,有时最后产品还不能令人满意 另外,有些生物大分子,往往在生物组织或发酵液中的含量很低,相对地说杂质很 多,特别是一些具有生物活性的分子,往往由于分离纯化的步骤很多,时间过长,造成 破坏以致失活,产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十 分有效的方法。它具有分离快速,纯化效率高。特别是对于那些含量少,杂质多,采用 常规方法难于分离的生物活性分子,显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度 可提高几倍,十几倍甚至几百倍。因此,亲和层析技术已成为纯化生物分子,特别是纯 化生物活性物质最重要的方法之 二、实验目的与要求 1.理解亲和层析法的基本原理,并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作 方法; 2.理解和掌握亲和层析实验操作技术 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法 三、基本原理 简言之,亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有 定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方 法 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分 子可逆地结合的特性(分子间通过某些次级键结合,如范德华力,疏水力,氢键等,在 一定条件下又可解离)。如:酶和底物(包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似 物)的结合。特异性的抗体一抗原(包括病毒、细胞)、激素与其受体、载体蛋白,基 因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合,植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多 糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和 层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物 专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中,只要把被识别的分子,称为配基( Ligand),在不损害其生物学功 能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上(Mtx,如 Sepharose4B)制成亲和吸附247 实验十一 亲和层析纯化胰蛋白酶 一、引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的 手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是， 这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不 同，或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物分子间物理和化学性 质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物 化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定 的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。 另外 ，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很 多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成 破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十 分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用 常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度 可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯 化生物活性物质最重要的方法之一。 二、实验目的与要求 1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作 方法； 2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术； 3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。 三、基本原理 简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一 定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方 法。 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分 子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在 一定条件下又可解离）。如：酶 和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似 物）的结合。特异性的抗体一抗 原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，基 因与其互补 DNA、mRNA 及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多 糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和 层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物 专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生物学功 能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如 Sepharose 4B）制成亲和吸附