例7.2.2L赖氮酸生产菌种选育 下面以L-赖氨酸生产菌种选育为例说明营养缺陷一调节突变菌株的选育方法。L-赖氨 酸和L-苏氨酸的合成途径参考图7.23。若以乳酸发酵棒杆菌作为出发菌种,对该菌种而言, 单独或同时加入L赖氨酸和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶,参与L-赖氨酸合成的二氢 吡啶羧酸合成酶又会受到L亮氨酸的阻遏,这种代谢调节作用称为“代谢联锁”。育种工 作的第一步是在含SAEC的培养基上筛选出SAEC抗性的调节突变菌株,使菌株中的天冬 氨酸激酶对L-赖氨酸和Ⅰ-苏氨酸不敏感,L-赖氨酸生产能力达到18g/L:第二步,在SAEC 抗性的调节突变菌株基础上进一步筛选出L-亮氨酸缺陷型突变株,解除L-亮氨酸对二氢二 吡啶羧酸合成酶的阻遏,营养缺陷一调节突变菌株的L-赖氨酸生产能力进一步提高到 4lg/①L。从SAEC抗性的调节突变菌株选育丙氨酸营养缺陷型也能够获得L-赖氨酸的高产菌 种。丙氨酸是从丙酮酸经丙酮酸_L-氨基酸转氨酶或从L-天冬氨酸经L-天冬氨酸-β-脱氢酶 合成的,而丙酮酸和L天冬氨酸是L赖氨酸和L-丙氨酸合成的共同前体,因此如果能够切 断合成丙氨酸的代谢途径,就增加了L-赖氨酸何尝的前体。为此在SAEC抗性的调节突变菌 株基础上筛选L-丙氨酸营养缺陷型菌株的L-赖氨酸产量也能达到39g/L。另外一种提高L 赖氨酸产量的育种方法是选育具有多重抗性的突变株。γ-甲基-L-丙氨酸和α-氯代己内酰胺 分别是L-丙氨酸和L亮氨酸的同形物,而且乳酸发酵棒杆菌对这两种同形物均高度敏感, 根据这一机理选育的一株对SAEC、Y甲基L-丙氨酸和a-氯代己内酰胺具有多重抗性的 L-丙氨酸营养缺陷型菌株的L赖氨酸产量提高到了60gL 表722通过调节突变和营养缺陷调节突变 获得的氨基酸生产菌种 产量 氨基酸 微生物 遗传标记 ArgHX, 6Al (L-精氨酸) Corynebacterium D-Ser, D-Arg, ArgHX, 2TA glutamicum Ile回复突变 2TA guanine 34.8 Brevibacterium flavum Arg(Fr), Arg(Rr), Arg(D) 35.0 Serratia marcescens ArgHX, 5HURT TRA, 6FT, 6AU 17.0 B. subtilis Bacillus subtilis ArgHX, 6AU, Arg 26.2 (L瓜氨酸) Cornebacterium TRA (L-组氨酸) TRA Leu C glutamicum TRAr, 6MG, 8AG, 4TUr, 6MPr, SMT 15.0 C glutamicum Histidase TRA 2MH 13.0 HiS-回复突变 3.5 (L异亮氨酸) nun AHVE OMI C glutamicum Met AHV. TIL AEC. Eth AZL ABA AHV, AEC Eth(碳源是乙酸) 37.5 AHV AEC Eth.a-AB. IlehX 30.08 例 7. 2. 2 L-赖氨酸生产菌种选育 下面以 L-赖氨酸生产菌种选育为例说明营养缺陷—调节突变菌株的选育方法。L-赖氨 酸和 L-苏氨酸的合成途径参考图 7.2.3。若以乳酸发酵棒杆菌作为出发菌种，对该菌种而言， 单独或同时加入 L-赖氨酸和 L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶，参与 L-赖氨酸合成的二氢二 吡啶羧酸合成酶又会受到 L-亮氨酸的阻遏，这种代谢调节作用称为“代谢联锁”。育种工 作的第一步是在含 SAEC 的培养基上筛选出 SAEC 抗性的调节突变菌株，使菌株中的天冬 氨酸激酶对 L-赖氨酸和 L-苏氨酸不敏感，L-赖氨酸生产能力达到 18g/L；第二步，在 SAEC 抗性的调节突变菌株基础上进一步筛选出 L-亮氨酸缺陷型突变株，解除 L-亮氨酸对二氢二 吡啶羧酸合成酶的阻遏，营养缺陷—调节突变菌株的 L-赖氨酸生产能力进一步提高到 41g/L。从 SAEC 抗性的调节突变菌株选育丙氨酸营养缺陷型也能够获得 L-赖氨酸的高产菌 种。丙氨酸是从丙酮酸经丙酮酸—L-氨基酸转氨酶或从 L-天冬氨酸经 L-天冬氨酸-β-脱氢酶 合成的，而丙酮酸和 L-天冬氨酸是 L-赖氨酸和 L-丙氨酸合成的共同前体，因此如果能够切 断合成丙氨酸的代谢途径, 就增加了 L-赖氨酸何尝的前体。为此在 SAEC 抗性的调节突变菌 株基础上筛选 L-丙氨酸营养缺陷型菌株的 L-赖氨酸产量也能达到 39g/L。另外一种提高 L- 赖氨酸产量的育种方法是选育具有多重抗性的突变株。γ-甲基-L-丙氨酸和α-氯代己内酰胺 分别是 L-丙氨酸和 L-亮氨酸的同形物，而且乳酸发酵棒杆菌对这两种同形物均高度敏感， 根据这一机理选育的一株对 SAEC、γ-甲基-L-丙氨酸和α-氯代己内酰胺具有多重抗性的 L-丙氨酸营养缺陷型菌株的 L-赖氨酸产量提高到了 60g/L。 表 7.2.2 通过调节突变和营养缺陷-调节突变 获得的氨基酸生产菌种 氨基酸 微生物 遗传标记 产量 G/L L-Arginine (L-精氨酸) Bacillus subtilis Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Serratia marcescens B. subtilis ArgHXr , 6AUr D-Serr , D-Argr , ArgHXr , 2TAr Ile 回复突变 2TAr , guanine－ Arg(Fr), Arg(Rr), Arg(D) ArgHXr , 5HURr , TRAr , 6FTr , 6AUr 28.0 25.0 34.8 35.0 17.0 L-Citrulline (L-瓜氨酸) Bacillus subtilis ArgHXr , 6AUr , Arg－ 26.2 L-Histidine (L-组氨酸) Corynebacterium glutamicum C. glutamicum C. glutamicum Serratia marcescens Streptomyces coelicolor TRAr TRAr , Leu－ TRAr ,6MGr ,8AGr ,4TUr , 6MPr , 5MTr Histidase－ , TRAr , 2MHr His-回复突变 7.0 11.0 15.0 13.0 3.5 L-isoleucine (L-异亮氨酸) Serratia marcescens Brevibacterium flavum C. glutamicum IleHXr , ABAr AHVr , OMTr Met － , AHVr , TILr , AECr , ETHr , AZLr , ABAr AHVr ,AECr ,Ethr (碳源是乙酸) AHVr ,AECr ,Ethr ,-ABr , IleHXr 12.0 14.5 8.7 37.5 30.0