,852 北京科技大学学报 第35卷 重力作用下，含菌溶液以约160Lm-2h-1速率流 布10.前人曾分离出多株极端嗜热菌，如球状硫化 经矿石层并与其发生反应，浸出富液从玻璃柱底部 叶菌(Sulfolobus tengchongensis,T=75℃，pH3.5)、 经橡胶管流入出液箱.当进液箱溶液即将消耗完时， 杆状极端嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi- 用蠕动泵将出液箱中浸出富液抽至进液箱进行循环 lus,T=8596℃，pH3.5)及球状极端嗜热古生菌 浸出. (Acidianus manzaen.si,T=65℃，pH1.5)等10-12， 1.4检测方法 本实验菌种与上述菌种，特别是Xia、He等7,12得 每4d用移液管抽取5mL浸出富液进行分析， 到的Acidianus manzaensis在生长温度、耐受酸度 取样损失以蒸馏水补偿.pH值及氧化还原电位采用 及能源获取方式等习性相近，为本研究提供了参考. SX-620型pH计测量（参照电极为Ag/AgCI):Fe2+ Acidianus manzaen.sis呈球状，能在T=65℃、pH1.5 离子浓度采用以二苯铵磺酸钠为指示剂的络合滴定 时促进黄铜矿和黄铁矿等硫化矿的溶解，其中浸出 法测量：总铁T℉e浓度采用SmCl2还原法将溶液中 黄铁矿时溶液中最终T℉e质量浓度为3gL-1,且 可溶性铁还原成Fe2+离子，再进行络合滴定：TFe 电位E.维持在300~450mV之间：而本实验菌株 和Fe2+离子浓度差值即为Fe3+离子浓度9.SO 呈短杆状，在T=70℃、pH2.0时浸出黄铁矿，检 离子浓度采用DX-120型离子色谱仪检测. 测到浸出富液中最终T℉e质量浓度为40gL-1,且 电位E维持在590650mV范围.结果表明两者 2结果与讨论 在细菌形貌及浸矿性能等方面存在差异，即本实验 2.1菌种鉴定 分离得到的极端嗜热硫杆菌是一种新型浸矿菌株. BLAST序列比对法表明，该菌株与Genbank 数据库中登录号为GQ062358.1的菌种基因序列相 似性达98%，两序列的同源性可靠性的评价值E为 0.进一步对比该菌与同源性较高的20株硫杆菌的 16 S rDNA,并利用软件Mega3.1构建其系统发育树 (图1)，可确定该极端嗜热菌为硫杆菌属 g238282058gbGQ062436.1 5238280144b1000522.1 i238281940gbGQ062318.1 2 i238281931gbGQ062309.1 =238281821g史G9062199.1 j238281863g 2 -238282032gbG0062410.1 833888:1 g23828206 062442. 62 238281901bGQ062279.1 302030918 gb HM595400.1 T38601165g5AY376698.1 238281874gb6GQ062252.1 图2极端嗜热硫杆菌扫描电镜像 i238282065gbGQ062443.1 238282043gbGQ062421.1 gm238281980gbGQ062358.1 Fig.2 SEM image of the extreme thermophilic Thiobacillus Target 图1极端嗜热硫杆菌16 S rDNA基因系统发育进化树 2.2不同浸出富液pH值及电位变化规律 Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the ex- 黄铁矿生物浸出富液的pH值及氧化还原电位 treme thermophilic Thiobacillus 随时间的变化曲线如图3所示.从图中可以看出， 对极端嗜热硫杆菌进行扫描电镜(SEM)分析， 在28d的生物浸出中，四组浸出富液pH值的变化 结果见图2.从图2可看出，该菌株呈短杆状，个体 趋势类似，即在前16d开始急剧下降，此后稳中有 大小比较平均，直径为12um.菌株革兰氏染色为 降，但总体上趋于平稳，最终pH值稳定在0.61.06 阴性.转代和驯化培养实验表明，该菌最适生长pH 具体原因为在浸出前期，富液中能源和氧气充足， 值为2.0，最适生长温度为70℃，在纯培养基中生 此时黄铁矿在细菌的催化作用下迅速氧化，并产生 长周期为17d,能以元素硫、Fe2+离子作为生长能 大量的酸（见式(1）(3)，因此导致富液的pH值急 源，并能耐受T℉e的最大质量浓度为40gL-1. 剧下降：而在浸出16d后，由于浸出体系中细菌繁 腾冲热海温泉水温5593℃，pH1.56.0, 殖与死亡数量达到动态平衡，将2+离子氧化为 水化学特征差异明显，嗜温菌种可能呈多样性分 Fe3+离子的速度减缓，黄铁矿的化学浸出和产酸量· 852 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 重力作用下，含菌溶液以约 160 L·m−2 ·h −1 速率流 经矿石层并与其发生反应，浸出富液从玻璃柱底部 经橡胶管流入出液箱. 当进液箱溶液即将消耗完时， 用蠕动泵将出液箱中浸出富液抽至进液箱进行循环 浸出. 1.4 检测方法 每 4 d 用移液管抽取 5 mL 浸出富液进行分析， 取样损失以蒸馏水补偿. pH 值及氧化还原电位采用 SX-620 型 pH 计测量 (参照电极为 Ag/AgCl)；Fe2+ 离子浓度采用以二苯铵磺酸钠为指示剂的络合滴定 法测量；总铁 TFe 浓度采用 SnCl2 还原法将溶液中 可溶性铁还原成 Fe2+ 离子，再进行络合滴定；TFe 和 Fe2+ 离子浓度差值即为 Fe3+ 离子浓度[9]. SO2− 4 离子浓度采用 DX-120 型离子色谱仪检测. 2 结果与讨论 2.1 菌种鉴定 BLAST 序列比对法表明，该菌株与 Genbank 数据库中登录号为 GQ062358.1 的菌种基因序列相 似性达 98%，两序列的同源性可靠性的评价值 E 为 0. 进一步对比该菌与同源性较高的 20 株硫杆菌的 16S rDNA，并利用软件 Mega3.1 构建其系统发育树 (图 1)，可确定该极端嗜热菌为硫杆菌属. 图 1 极端嗜热硫杆菌 16S rDNA 基因系统发育进化树 Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the ex￾treme thermophilic Thiobacillus 对极端嗜热硫杆菌进行扫描电镜 (SEM) 分析， 结果见图 2. 从图 2 可看出，该菌株呈短杆状，个体 大小比较平均，直径为 1∼2 µm. 菌株革兰氏染色为 阴性. 转代和驯化培养实验表明，该菌最适生长 pH 值为 2.0，最适生长温度为 70 ℃，在纯培养基中生 长周期为 17 d，能以元素硫、Fe2+ 离子作为生长能 源，并能耐受 TFe 的最大质量浓度为 40 g·L −1 . 腾冲热海温泉水温 55∼93 ℃， pH 1.5∼6.0， 水化学特征差异明显，嗜温菌种可能呈多样性分 布[10] . 前人曾分离出多株极端嗜热菌，如球状硫化 叶菌 (Sulfolobus tengchongensis, T=75 ℃，pH 3.5)、 杆状极端嗜热芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophi￾lus, T=85∼96 ℃，pH 3.5) 及球状极端嗜热古生菌 (Acidianus manzaensis, T=65 ℃，pH 1.5) 等[10−12] . 本实验菌种与上述菌种，特别是 Xia、He 等[7,12] 得 到的 Acidianus manzaensis 在生长温度、耐受酸度 及能源获取方式等习性相近，为本研究提供了参考. Acidianus manzaensis 呈球状，能在 T=65 ℃、pH 1.5 时促进黄铜矿和黄铁矿等硫化矿的溶解，其中浸出 黄铁矿时溶液中最终 TFe 质量浓度为 3 g·L −1，且 电位 Eh 维持在 300∼450 mV 之间；而本实验菌株 呈短杆状，在 T=70 ℃、pH 2.0 时浸出黄铁矿，检 测到浸出富液中最终 TFe 质量浓度为 40 g·L −1，且 电位 Eh 维持在 590∼650 mV 范围. 结果表明两者 在细菌形貌及浸矿性能等方面存在差异，即本实验 分离得到的极端嗜热硫杆菌是一种新型浸矿菌株. 图 2 极端嗜热硫杆菌扫描电镜像 Fig.2 SEM image of the extreme thermophilic Thiobacillus 2.2 不同浸出富液 pH 值及电位变化规律 黄铁矿生物浸出富液的 pH 值及氧化还原电位 随时间的变化曲线如图 3 所示. 从图中可以看出， 在 28 d 的生物浸出中，四组浸出富液 pH 值的变化 趋势类似，即在前 16 d 开始急剧下降，此后稳中有 降，但总体上趋于平稳，最终 pH 值稳定在 0.6∼1.06. 具体原因为在浸出前期，富液中能源和氧气充足， 此时黄铁矿在细菌的催化作用下迅速氧化，并产生 大量的酸 (见式 (1)∼(3))，因此导致富液的 pH 值急 剧下降；而在浸出 16 d 后，由于浸出体系中细菌繁 殖与死亡数量达到动态平衡，将 Fe2+ 离子氧化为 Fe3+ 离子的速度减缓，黄铁矿的化学浸出和产酸量