DNA-DNA杂交为例,较详细地介绍 Southern印迹法。将DNA样品经限制性内切酶降解 后,用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱(NaOH)中使DNA进行变性,然后将变 性DNA转移到硝酸纤维素膜上(硝酸纤维素膜只吸附变性DNA),在80℃烤4~6,使 DNA牢固地吸在纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的DNA,探针进行杂交。 杂交须在较高的盐浓度及适当的温度(一般为68℃)下进行数小时或十余小时,然后通过 洗涤除去未杂交上的标记物。将纤维素膜烘干后进行放射自显影。 除了DNA外,RNA也可用作探针( Probe)。用3P标记核酸时(用作探针),可以在 3′或5′末端标记,也可采用均匀标记 应用类似的方法也可分析RNA,即将RNA变性后转移到纤维素膜上再进行杂交。这 种方法称为 Northern印迹法( northern blotting)。用类似的方法,根据抗体与抗原可以结 合的原理,也可以分析蛋白质。这个方法称为 Westem印迹法( Western blotting) 应用核酸杂交技术,可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来 五核酸的酸解和碱解 核酸在酸、碱或酶的作用下,发生共价键断裂,多核苷酸链被打断,分子量变小,这 种过程称为降解。核酸的酶促降解可参阅第十章。下面简要讨论酸和碱对核酸的降解作用 (一)酸解酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间长短而不同。用温和的或 稀的酸作短时间处理,DNA和RNA都不发生降解。但延长处理时间或提高温度,或提高 酸的强度,则会使核酸中的部分糖苷键发生水解,先是嘌呤碱基被水解下来,生成无嘌呤 的核酸,同时少数磷酸二酯键也发生水解,使链断裂。若用中等强度的酸在100℃下处理 数小时,或用较浓的酸(如2~6md/HCL)处理,则可使嘧啶碱基水解下来,更多的 磷酸二酯键断裂,核酸降解程度增加。 (二)碱解RNA在稀碱条件下很容易水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。因为 RNA中的核糖具有2’一OH,在碱催化下3’,5’一磷酸二酯键断裂,先形成中间物2 3’环核苷酸,它不稳定而进一步水解,生成2’一核苷酸和3’一核苷酸混合物。反应 过程如下:－93－ DNA-DNA 杂交为例，较详细地介绍 Southern 印迹法。将 DNA 样品经限制性内切酶降解 后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱（NaOH）中使 DNA 进行变性，然后将变 性 DNA 转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性 DNA），在 80℃烤 4～6h，使 DNA 牢固地吸在纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的DNA，探针进行杂交。 杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般为 68℃）下进行数小时或十余小时，然后通过 洗涤除去未杂交上的标记物。将纤维素膜烘干后进行放射自显影。 除了 DNA 外，RNA 也可用作探针（Probe）。用 32P 标记核酸时（用作探针），可以在 3′或 5′末端标记，也可采用均匀标记。 应用类似的方法也可分析 RNA，即将 RNA 变性后转移到纤维素膜上再进行杂交。这 种方法称为 Northern 印迹法（Northern blotting）。用类似的方法，根据抗体与抗原可以结 合的原理，也可以分析蛋白质。这个方法称为 Western 印迹法（Western blotting）。 应用核酸杂交技术，可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来。 五 核酸的酸解和碱解 核酸在酸、碱或酶的作用下，发生共价键断裂，多核苷酸链被打断，分子量变小，这 种过程称为降解。核酸的酶促降解可参阅第十章。下面简要讨论酸和碱对核酸的降解作用。 （一）酸解 酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间长短而不同。用温和的或 稀的酸作短时间处理，DNA 和 RNA 都不发生降解。但延长处理时间或提高温度，或提高 酸的强度，则会使核酸中的部分糖苷键发生水解，先是嘌呤碱基被水解下来，生成无嘌呤 的核酸，同时少数磷酸二酯键也发生水解，使链断裂。若用中等强度的酸在 100℃下处理 数小时，或用较浓的酸（如 2～6mol/LHCL） 处理，则可使嘧啶碱基水解下来，更多的 磷酸二酯键断裂，核酸降解程度增加。 （二）碱解 RNA 在稀碱条件下很容易水解生成 2’－核苷酸和 3’－核苷酸。因为 RNA 中的核糖具有 2’－OH，在碱催化下 3’,5’－磷酸二酯键断裂，先形成中间物 2’ －3’环核苷酸，它不稳定而进一步水解，生成 2’－核苷酸和 3’－核苷酸混合物。反应 过程如下：