常用的负染色液 2.醋酸铀:用重蒸水配成0.2~0.5%水溶液,pH4.5左右。醋酸铀对光不稳定,避光保存。 能较好地显示病毒颗粒结构的细节,反差较强,对样品的破坏作用小,缺点是细小的颗粒性的杂质 较多,需过滤后使用 3.甲酸铀:适用于具螺旋对称的病毒颗粒,能显示出病毒的蛋白质亚基结构,用重蒸水配成0.5~ 1%水溶液,p值为3·5,使用时用IN氢氧化钠将pH值调至4.5~5.2。甲酸铀极不稳定 4.钼酸铵:适用于有界膜的生物样品的负染,反差较弱,但性能稳定,破坏作用小。一般用重蒸 永配成1~2%水溶液,使用时用盐酸或氨水调pH4.0~9.0。 染色方法 1.滴染法 (1)先将样品制备成适当浓度的悬浮液,用细滴管吸取悬液滴在有支持膜的铜网上使其形成一小液 滴。静置片刻,用小滤纸尖在铜网边缘吸去多余的样品,使样品在铜网上仅留一薄层液膜,在液膜 未干时滴上染液,染色1-2min,用滤纸尖在铜网边缘吸去染液,自然干后即可观察。这是常规的 负染方法。 (2)有些样品(如病毒)的悬液滴在铜网上形成边缘分布,用滤纸吸时丢失的样品较多,可用微量加 样器在铜网中部加一小滴样品悬液。放在自然状态下(或放在灯下微加热),待液滴未干时加一小滴 染液,令其自然干燥。这种方法对一些浓度低的样品可有较好的效果 2.漂浮法:在封口膜上滴几滴样品悬液,再将有支持膜的铜网膜面朝下漂浮在样品液滴上。漂浮 片刻,样品被吸附在铜网的支持膜上,取出铜网用滤纸尖吸去样品余液,铜网上仅留一薄层液膜, 待液膜未干时,放于染液的液滴上漂浮。染色1~2min后吸去染液,自然干燥。也可在染液液滴中 加入少量样品,混匀,将有支持膜的铜网漂浮在混合液面上,用滤纸吸去余液后自然干燥。 负染色应注意的问题 负染色液的p值 2.样品悬液的p值:一般应使样品悬液呈中性或稍偏酸性ΦpH6~7为宜) 3.样品悬液的纯度:需提纯 4.样品与染液的均匀分布:采用某些分散剂 (1)牛血清白蛋白(BSA):适用于高度纯化的颗粒性悬液,方法是把0·005-0·05%牛血清白蛋 白溶液加到样品悬液内。 (2)杆菌肽:接30-50mg/m1的浓度配制成水溶液,作为沉淀物的稀释液。 5.染色时机:一般应在滤纸吸去样品悬液之后稍等片刻,在看不见残留的液体但又未干燥时滴加 染液 扫描电镜样品制备技术 多数生物样品有两个弱点:一是含有较多的水分,而且去掉水分发生变形;二是干燥后的样品 不导电。干燥和导电是扫描电镜制样的关键。如何把生物样品干燥而又不产生形变?目前有多种方 法,空气干燥法、临界点干燥法、真空干燥法、冰冻干燥法等等。 常规方法 1.取材:取样时要准确。体积不宜过大,以减少不必要的观察量。并且解剖用具要锋利,动作要 轻巧,防止因挤压而损伤样品。 2.固定:一般进行双固定,即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下前固定,再用1% 锇酸/缓冲液在4℃下固定1060分钟 3.清洗:(1)蛋白酶消化 (2)去除粘液法(3)超声法 4脱水和置换:系列乙醇或丙酮逐级脱水.用乙酸异戊酯置换100%的乙醇。 5干燥:临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等 6喷涂:喷涂要在真空条件下进行真空喷镀法和离子溅射法 干燥样品的方法 临界点干燥 基本原理:在一定的温度和压力之下,某物质的液态和气态界面消失,由液态瞬间转化为气态。常用的负染色液 2．醋酸铀：用重蒸水配成 0．2～ 0．5％水溶液，pH4．5 左右。醋酸铀对光不稳定，避光保存。 能较好地显示病毒颗粒结构的细节，反差较强，对样品的破坏作用小，缺点是细小的颗粒性的杂质 较多，需过滤后使用。 3．甲酸铀 ：适用于具螺旋对称的病毒颗粒 ，能显示出病毒的蛋白质亚基结构，用重蒸水配成 O．5～ 1％水溶液，pH 值为 3·5 ，使用时用 lN 氢氧化钠将 pH 值调至 4．5～5．2。甲酸铀极不稳定。 4．钼酸铵：适用于有界膜的生物样品的负染，反差较弱，但性能稳定，破坏作用小。一般用重蒸 永配成 1～2％水溶液，使用时用盐酸或氨水调 pH4．0～9．O。 染色方法 1．滴染法： (1)先将样品制备成适当浓度的悬浮液，用细滴管吸取悬液滴在有支持膜的铜网上使其形成一小液 滴。静置片刻，用小滤纸尖在铜网边缘吸去多余的样品，使样品在铜网上仅留一薄层液膜，在液膜 未干时滴上染液，染色 1-2min，用滤纸尖在铜网边缘吸去染液，自然干后即可观察。这是常规的 负染方法。 (2)有些样品(如病毒)的悬液滴在铜网上形成边缘分布，用滤纸吸时丢失的样品较多，可用微量加 样器在铜网中部加一小滴样品悬液。放在自然状态下(或放在灯下微加热)，待液滴未干时加一小滴 染液，令其自然干燥。这种方法对一些浓度低的样品可有较好的效果。 2．漂浮法：在封口膜上滴几滴样品悬液，再将有支持膜的铜网膜面朝下漂浮在样品液滴上。漂浮 片刻，样品被吸附在铜网的支持膜上，取出铜网用滤纸尖吸去样品余液，铜网上仅留一薄层液膜， 待液膜未干时，放于染液的液滴上漂浮。染色 1～2min 后吸去染液，自然干燥。也可在染液液滴中 加入少量样品，混匀，将有支持膜的铜网漂浮在混合液面上，用滤纸吸去余液后自然干燥。 负染色应注意的问题 1．负染色液的 pH 值： 2 ．样品悬液的 pH 值：一般应使样品悬液呈中性或稍偏酸性(pH6～7 为宜) 。 3 ．样品悬液的纯度：需提纯 4．样品与染液的均匀分布：采用某些分散剂 (1)牛血清白蛋白(BSA) ：适用于高度纯化的颗粒性悬液，方法是把 0·005－0·05％牛血清白蛋 白溶液加到样品悬液内。 (2)杆菌肽： 接 30－50mg／ml 的浓度配制成水溶液，作为沉淀物的稀释液。 5．染色时机：一般应在滤纸吸去样品悬液之后稍等片刻，在看不见残留的液体但又未干燥时滴加 染液。 扫描电镜样品制备技术 多数生物样品有两个弱点 ：一是含有较多的水分，而且去掉水分发生变形；二是干燥后的样品 不导电。干燥和导电是扫描电镜制样的关键。如何把生物样品干燥而又不产生形变?目前有多种方 法，空气干燥法、临界点干燥法、真空干燥法、冰冻干燥法等等。 一常规方法 1．取材：取样时要准确。体积不宜过大，以减少不必要的观察量。并且解剖用具要锋利，动作要 轻巧，防止因挤压而损伤样品。 2．固定：一般进行双固定，即先用 1％～3％的戊二醛／缓冲液在室温或 4℃下前固定，再用 1％ 锇酸／缓冲液在 4℃下固定 10~60 分钟。 3．清洗： (1)蛋白酶消化法： (2)去除粘液法 (3)超声法 4 脱水和置换：系列乙醇或丙酮逐级脱水．用乙酸异戊酯置换 100％的乙醇。 5 干燥：临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等 6 喷涂：喷涂要在真空条件下进行真空喷镀法和离子溅射法 干燥样品的方法 一、临界点干燥 基本原理：在一定的温度和压力之下，某物质的液态和气态界面消失，由液态瞬间转化为气态