膜为 Formvar(聚乙烯醇缩甲醛),用氯仿配制0.3% Formvar制膜液。 2.玻璃刀的制作 钻石刀质地坚硬锋利,经久耐用,但其价格昂贵,操作要求也很严格。玻璃刀,其制作简便,价格 低廉,但刀刃不耐用 3.包埋块的修整: 4.超薄切片:装包埋块.装玻璃刀,检査刀刃.调节样品与刀刃的关系,加槽液,选择切片速度, 切片,捞切片。 超薄切片的染色 光学显微镜切片是经过各种生物染料染色后呈现不同颜色,以此来识别各种组织结构。 超薄切片的染色以组织细胞的不同结构对电子散射程度不同,而显示出各种超微结构,染色的目 的是增强样品中各种结构的电子散射能力,提髙样品的反差,只呈现黑白对比。 电子染色:利用某些重金属盐(如铀,铅、锇、钨等)能与细胞的某些结构成分相结合.以增强电 子散射能力,从而达到提高样品反差的目的 超薄切片常用的染色液 普遍采用双重染色法,即先用铀染色,再用铅染色。 (1)醋酸双氧铀:能与组织细胞内大多数成分结合,但对膜结构染色效果较差。用50%或70%乙 醇配制,染色液一般用1-3%的饱和溶液。淡黄色,最适pH值为4~5。对光不稳定,应密封避光 冷藏,其有一定的放射性和化学毒性。 (②)柠檬酸铅:具有很髙的电子密度,对细胞各结构成分均显示极大的亲和力,尤其对细胞膜系统 及脂类物质的反差很好 硝酸铅Pb(NO3)2 柠檬酸钠Na3CH50;·2H20 1.76g 双蒸水 30m1 上述成分充分混匀后加入1N氢氯化钠水溶液8m1,使溶液透明,然后再用双蒸水加至50ml。 超薄切片的染色 常用滴染法 1.铀染:将醋酸双氧铀染液滴于蜡盘中,将捞有切片的铜网(有切片面)朝下漂浮在染液液滴上, 避光染色15~30min。用镊子夹持铜网依次在3个盛有重蒸水的小烧杯中作上下运动以进行清洗。 每回清洗各2030次,再用滤纸尖吸去水分 2.铅染:另一蜡盘中的四周放一些固体氢氧化钠。柠檬酸铅染液滴于蜡盘中,将铀染后的铜 网切片面朝下漂浮在染液液滴上,盖严蜡盘盖,染色10~20min,在另外3杯重蒸水中清洗后吸干 备用 负染色技术 正染色:超薄切片的染色是用某些染色剂增强样品结构本身的电子密度,在图像中呈现黑色,背 景未被染色而呈现光亮。 负染色:是用某些高电子密度的物质包围低电子密度的样品,结果在图像中背景是黑色,而样品 却呈现透明的光亮,这样在黑色的背景中就很清晰地反衬出光亮的样品形貌 负染色技术:快速简易,而且分辨率高(可达20A)。可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的 细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、大小及表面结构的特征 常用的负染色液 应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力以产生足够的图像反差,在电子束的轰击下不升 华,溶解度大,不易析出沉淀,而且在电镜下不呈现可见结构,分子小,容易渗入不规则表面的凹 陷中,与样品不发生化学反应等特征。 1.磷钨酸钾(PTA):包括磷钨酸钾(KPT)和磷钨酸钠(aP),用重蒸水配成1~3%的水溶液使 用时,应用IN氢氧化钠溶液将负染液的pH值调至6.4~7.0,可保存在室温下,比较稳定。适 用于大多数直接取样的样品和纯化样品,颗粒细,反差良好,图像背景干净,杂质少。缺点是显示 样品结构细节较差。膜为 Formvar (聚乙烯醇缩甲醛) ， 用氯仿配制 0．3％Formvar 制膜液。 2．玻璃刀的制作： 钻石刀质地坚硬锋利，经久耐用，但其价格昂贵，操作要求也很严格。玻璃刀，其制作简便，价格 低廉，但刀刃不耐用。 3 ．包埋块的修整 ： 4．超薄切片：装包埋块．装玻璃刀，检查刀刃．调节样品与刀刃的关系，加槽液，选择切片速度， 切片,捞切片。 超薄切片的染色 光学显微镜切片是经过各种生物染料染色后呈现不同颜色，以此来识别各种组织结构。 超薄切片的染色以组织细胞 的不同结构对电子散射程度不同，而显示出各种超微结构，染色的目 的是增强样品中各种结构 的电子散射能力， 提高样品的反差，只呈现黑白对比。 电子染色 ：利用某些重金属盐(如铀，铅、锇、钨等)能与细胞的某些结构成分相结合．以增强电 子散射能力，从而达到提高样品反差的目的。 超薄切片常用的染色液 普遍采用双重染色法，即先用铀染色，再用铅染色。 (1)醋酸双氧铀 ：能与组织细胞内大多数成分结合，但对膜结构染色效果较差。用 50％或 70％乙 醇配制，染色液一般用 1－3％的饱和溶液。淡黄色，最适 pH 值为 4～5。对光不稳定，应密封避光 冷藏，其有一定的放射性和化学毒性。 (2)柠檬酸铅 ：具有很高的电子密度，对细胞各结构成分均显示极大的亲和力，尤其对细胞膜系统 及脂类物质的反差很好 硝酸铅 Pb(NO３)２ l ．33 g 柠檬酸钠 Na３C６H５O７·2H２O 1．76 g 双蒸水 30ml 上述成分充分混匀后加入１ N 氢氯化钠水溶液 8ml ，使溶液透明，然后再用双蒸水加至 50m1 。 超薄切片的染色 常用滴染法 ： 1．铀染 ：将醋酸双氧铀染液滴于蜡盘中，将捞有切片的铜网（有切片面）朝下漂浮在染液液滴上， 避光染色 15~30min。用镊子夹持铜网依次在 3 个盛有重蒸水的小烧杯中作上下运动以进行清洗。 每回清洗各 20~30 次，再用滤纸尖吸去水分。 2．铅染 ：另一蜡盘中的四周放一些固体氢氧化钠。柠檬酸铅染液滴于蜡盘中， 将铀染后的铜 网切片面朝下漂浮在染液液滴上，盖严蜡盘盖，染色 10~20min，在另外 3 杯重蒸水中清洗后吸干 备用。 负染色技术 正染色 ：超薄切片的染色是用某些染色剂增强样品结构本身的电子密度，在图像中呈现黑色，背 景未被染色而呈现光亮 。 负染色 ：是用某些高电子密度的物质包围低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑色，而样品 却呈现透明的光亮，这样在黑色的背景中就很清晰地反衬出光亮的样品形貌 。 负染色技术：快速简易，而且分辨率高(可达 20A) 。可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的 细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、大小及表面结构的特征 。 常用的负染色液 应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力以产生足够的图像反差，在电子束的轰击下不升 华，溶解度大，不易析出沉淀，而且在电镜下不呈现可见结构，分子小，容易渗入不规则表面的凹 陷中，与样品不发生化学反应等特征。 1．磷钨酸钾 (PTA)：包括磷钨酸钾(KPT)和磷钨酸钠(NaPT) ，用重蒸水配成 l～3％的水溶液使 用时，应用 1N 氢氧化钠溶液将负染液的 pH 值调至 6．4～7．O ，可保存在室温下，比较稳定。适 用于大多数直接取样的样品和纯化样品，颗粒细，反差良好，图像背景干净，杂质少。缺点是显示 样品结构细节较差