(3)固定液的渗透压 (4)组织块大小:固定液的渗透速度慢,组织块一定要小 5)固定温度:通常在040C固定。 漂冼 戊二醛与四氧化锇产生氧化还原反应生成细致的沉淀,四氧化锇与脱水剂也会发生反应生成沉淀, 因此在双固定之间和在脱水前必须用相应的缓冲液充分漂洗,漂洗时间一般为3060mid,也可几 小时或过夜,其间更换几次漂洗液 脱水 常用的包埋剂是非水溶性的,因此样品必须用脱水剂把组织细胞内的游离水去除干净。 常用的脱水剂:乙醇和丙酮。 采用运级脱水.即逐级升高脱水剂的浓度,逐步把水分置换出来的方法。50%70%80%一 90%-95%-100%(3次),样品在每一浓度停留10~20min 脱水一定要彻底.特别是无水乙醇(或丙酮)中不能含有水分。 渗透、包埋与聚合 理想的包埋剂应具备以下条件:粘度低。容易渗入组织。聚合均匀充分.聚合后体积收缩小,组织 无变形,对细胞成分提取少,精细结构保存良好,透明度好;在电镜髙倍放大下不显示结构,能耐 受电子束的轰击,有良好的切割性能,切片易染色。对人体无害。 最常用的包埋剂是环氧树脂,优点是聚合均匀。收缩率小(小于2%),不易生成气泡,在电子束的 轰击下切片十分稳定,能很好地保存细胞的精细结构。 常用包埋剂 (1)Epon812: 冬季:Epon81213m1,DDSA8ml 夏季:Epon812 13m1, DDSA 7ml NMA 8ml 配好混合液后可置于冰箱内保存备用,使用前以1.5~2%的体积比.逐滴加入DMP-30,并充分搅 匀 常用包埋剂 (2)618包埋剂 环氧树脂618 5m1 DDSA 2ml DBP 5m1 DM 1~1.5% 依次棍合前4种于40~50°C下搅拌20~30min,逐滴加入DP-30,再充分搅拌后放置37°C温箱中 使气泡逸出 渗透 渗透:用包埋剂逐步渗入组织细胞内取代脱水剂,使细胞内外所有的空隙都被包埋剂填充。即用 包埋剂逐步取代脱水剂。样品置于100%丙酮及等量包埋剂混合液中渗透数小时,再将样品置于纯 包埋剂中过夜或更长。如用乙醇作为脱水剂,样品在进入包埋剂前应用环氧丙烷或丙酮过渡 包埋与聚合 包埋与聚合:将渗透好的组织块放入适当的模具中,灌满包埋剂包埋,再经加温使包埋剂聚合成 坚硬的固体。 包埋:(1)常规包埋(2)定向包埋(3)倒扣胶囊,包埋室内湿度最好在60%左右。 聚合:恒温箱中加温聚合。聚合时间:一般为37°C12小时,450C12小时·60°C24小时;也 可在60°C一次聚合48小时。 超薄切片 1.支持膜的制备: 铜网上覆盖的这层薄膜叫支持膜,厚度约200A,透明无结构.能承受电子束的轰击。常用的支持(3)固定液的渗透压 (4)组织块大小：固定液的渗透速度慢，组织块一定要小。 (5)固定温度：通常在 O~4０C 固定。 漂冼 戊二醛与四氧化锇产生氧化还原反应生成细致的沉淀，四氧化锇与脱水剂也会发生反应生成沉淀， 因此在双固定之间和在脱水前必须用相应的缓冲液充分漂洗，漂洗时间一般为 30~60mid，也可几 小时或过夜，其间更换几次漂洗液。 脱水 常用的包埋剂是非水溶性的，因此样品必须用脱水剂把组织细胞内的游离水去除干净。 常用的脱水剂：乙醇和丙酮。 采用运级脱水．即逐级升高脱水剂的浓度，逐步把水分置换出来的方法。 50％一 70％一 80％一 90％一 95％一 100％(3 次)，样品在每一浓度停留 10～20min。 脱水一定要彻底．特别是无水乙醇(或丙酮)中不能含有水分。 渗透、包埋与聚合 理想的包埋剂应具备以下条件：粘度低。容易渗入组织。聚合均匀充分．聚合后体积收缩小，组织 无变形，对细胞成分提取少，精细结构保存良好，透明度好；在电镜高倍放大下不显示结构，能耐 受电子束的轰击，有良好的切割性能，切片易染色。对人体无害。 最常用的包埋剂是环氧树脂，优点是聚合均匀。收缩率小(小于 2％)，不易生成气泡，在电子束的 轰击下切片十分稳定，能很好地保存细胞的精细结构。 常用包埋剂 (1)Epon 812 ： 冬季：Epon 812 13ml， DDSA 8ml NMA 7ml 夏季：Epon 812 13ml， DDSA 7m1 NMA 8ml 配好混合液后可置于冰箱内保存备用，使用前以 1．5～2％的体积比．逐滴加入 DMP-30，并充分搅 匀 。 常用包埋剂 (2 )618 包埋剂 ： 环氧树脂 618 5ml DDSA 2ml NMA 2．5ml DBP 1．5ml DMP-30 l～1．5％ 依次棍合前 4 种于 40～50０ C 下搅拌 20～30min，逐滴加入 DMP-30，再充分搅拌后放置 37０ C 温箱中 使气泡逸出 渗透 渗透 ：用包埋剂逐步渗入组织细胞内取代脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂填充。即用 包埋剂逐步取代脱水剂。样品置于 100％丙酮及等量包埋剂混合液中渗透数小时，再将样品置于纯 包埋剂中过夜或更长。如用乙醇作为脱水剂，样品在进入包埋剂前应用环氧丙烷或丙酮过渡。 包埋与聚合 包埋与聚合 ：将渗透好的组织块放入适当的模具中，灌满包埋剂包埋，再经加温使包埋剂聚合成 坚硬的固体。 包埋 ：(1)常规包埋 (2)定向包埋 (3)倒扣胶囊，包埋室内湿度最好在 60 ％左右。 聚合 ：恒温箱中加温聚合。 聚合时间：一般为 37０ C12 小时，45０ C12 小时· 60０ C 24 小时 ；也 可在 60０ C 一次聚合４8 小时 。 超薄切片 1 ．支持膜的制备 ： 铜网上覆盖的这层薄膜叫支持膜，厚度约 200A，透明无结构．能承受电子束的轰击。常用的支持