1936 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2016,51(12):1934-1938 与受体的亲和力比1提高5倍,但对细胞的抑制活应的缘故,在肝脏中发生氧化代谢而失活。通过16 性有所降低,分析原因可能是13的亲脂性过强(clog与微粒体温孵,温孵液的氧化产物(往往是醛酮类化 P=61),而1的clgP=4.5,亲脂性过强不利于溶解合物)用氨基脲捕获羰基化合物,质谱分析加成物, 与扩散。为了调整亲脂/亲水性,用有极性的基得知是二氮草的7位被氧化成羟基,开环成醛基而形 团连接苯环,其中发现三唑化合物14( (clog P=41)成的缩氨脲。二氮草开环,打散了16的刚性结构 的受体结合实验维持高活性,并且对细胞的抑制活苯环上的甲基也可被氧化,以及喹唑啉的氧化等。如 性也显著提高,两株细胞的IC50分别为36nmoL+图1所示的代谢位点。 和39 nmol- L-。苯环与三唑连接的位置对活性影响 较大,例如1-三唑化合物对Ox1R和Ox2R的K值分 别为1050和75 moll。在2-三唑取代的基础上连 接甲基,化合物15的活性更高。 氧化成羟甲基和羧基 4里程碑式化合物一候选药物作为先导化合物 羟基化 综合上述以不变的14-二氮草母核为中心的结 羟基化开环生成醛基 构优化,将对活性贡献最大的片段组合在一起,设计图1化合物16被氧化代谢的位点 合成了对Ox1R和Ox2R受体有高活性的双重拮抗剂 16。由于OxR和OxR是研发睡眠药的新靶标,化51增加位阻避免代谢一二氮草环上引入取代基 合物16应显示体内效果,即对实验动物应有催眠作阻止氧化代谢的一个方法是在代谢位点附近引入基 用。通过受体水平、细胞水平和动物实验,对靶标和团以增加位阻,为此在二氮草的不同位置作不同的 化合物双方的成药性进行概念验证 取代。 首先,成功完成了不同取代的二氮草环的合成 共制备了15个单取代和二取代的二氮草母核,通过 Ox Ki=1.2 nmol. L- 通量的合成和活性测试,证明2、6或7位引入基团 Ox:RKi=2. 6 nmol. L 不仅不影响与受体的结合,而且还提高了活性强度 CH3 OXIR ICso-29 nmol 将这些有潜在活性的母核与不同的杂环和(或)不 Ox,R ICso=27 nmol-L- 同取代的苯甲酸缩合,得到了大量目标化合物。生物 为证明16能够阻断脑中 orexin-受体的信号通路 学评价分3步走:首先测定对双靶标Ox1R/Ox2R的 测定了化合物对大鼠脑切片的中缝背核中的神经元活性,然后犬静脉注射测定清除率以评价代谢速率 放电频率的调节作用,结果表明16能够抑制 orexin a和程度,在此基础上评价口服生物利用度。综合评价 引起的神经元放电频率,并且抑制强度与给药浓度化合物的活性、药代和物化性质,确定了单取代的7 呈正相关性。化合物16灌胃大鼠的体内实验表明,可甲基二氮草为母核,做进一步优化 抑制 orexin信号系统,减少了大鼠的清醒时间。并在52喹唑啉环上的取代在合成的化合物中,有代 大鼠的各种状态下,记录皮层脑电图和心电图,都表表性的化合物17~19对两种Ox1ROx2R受体的结合 明该双重抑制剂促进了睡眠过程。 力与抑制活性都很高,然而犬的药代实验表明,化合 化合物16的 clog P=3,实测logP=29,可形物17和18的药代性质与16相比没有明显改善,而 成盐酸盐以提高溶解性,而且有良好的过膜性(P4=6-氟代喹唑啉化合物19的生物利用度和清除率都优 38×10°cms-)。然而,大鼠灌胃16的生物利用度很于16,灌胃引起大鼠同样睡眠的剂量只是化合物16 低,F=29%半衰期很短,2=21min。对犬的F=16%,的十分之一,药效高是因药代好之故。表3列出了这 tn=128h,这些较差的药代性质未能达到成药性的些化合物的活性和犬的药代数据 要求,需要在化合物16的基础上进一步优化( Whitman 然而化合物19出现新的问题,即在体内经氧化 DB, COx CD, Breslin m,etal! ChemMedChem,2009,代谢生成亲电性基团,有潜在的毒性。用微粒体与19 4:1069-1074) 温孵,加入谷胱甘肽(GSH)以捕获亲电试剂,仪器 5第二轮的优化一改善药代动力学性质(从研究代检测到了GSH加成产物。药物代谢产生亲电性物质 谢产物入手) 往往引起特质性毒性反应,因而化合物19不能作为 化合物16生物利用度低的主要原因是有首过效候选化合物。因此优化的目标又加上了是否会因代谢· 1936 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (12): 1934 −1938 与受体的亲和力比 1 提高 5 倍, 但对细胞的抑制活 性有所降低, 分析原因可能是 13 的亲脂性过强 (clog P = 6.1), 而 1 的 clog P = 4.5, 亲脂性过强不利于溶解 与扩散。为了调整亲脂 /亲水性, 用有极性的基 团连接苯环, 其中发现三唑化合物 14 (clog P = 4.1) 的受体结合实验维持高活性, 并且对细胞的抑制活 性也显著提高, 两株细胞的 IC50 分别为 36 nmol·L −1 和 39 nmol·L −1。苯环与三唑连接的位置对活性影响 较大, 例如 1-三唑化合物对 Ox1R 和 Ox2R 的 Ki 值分 别为 1 050 和 75 nmol·L −1。在 2-三唑取代的基础上连 接甲基, 化合物 15 的活性更高。 4 里程碑式化合物—候选药物作为先导化合物 综合上述以不变的 1,4-二氮䓬母核为中心的结 构优化, 将对活性贡献最大的片段组合在一起, 设计 合成了对 Ox1R 和 Ox2R 受体有高活性的双重拮抗剂 16。由于 Ox1R 和 Ox2R 是研发睡眠药的新靶标, 化 合物 16 应显示体内效果, 即对实验动物应有催眠作 用。通过受体水平、细胞水平和动物实验, 对靶标和 化合物双方的成药性进行概念验证。 为证明 16 能够阻断脑中 orexin-受体的信号通路, 测定了化合物对大鼠脑切片的中缝背核中的神经元 放电频率的调节作用, 结果表明 16 能够抑制 orexin A 引起的神经元放电频率, 并且抑制强度与给药浓度 呈正相关性。化合物 16 灌胃大鼠的体内实验表明, 可 抑制 orexin 信号系统, 减少了大鼠的清醒时间。并在 大鼠的各种状态下, 记录皮层脑电图和心电图, 都表 明该双重抑制剂促进了睡眠过程。 化合物 16 的 clog P = 3.1, 实测 log P = 2.9, 可形 成盐酸盐以提高溶解性, 而且有良好的过膜性 (Papp = 38×10−6 cm·s −1 )。然而, 大鼠灌胃 16 的生物利用度很 低, F=2%, 半衰期很短, t1/2=21 min。对犬的 F=16%, t1/2 = 1.28 h, 这些较差的药代性质未能达到成药性的 要求, 需要在化合物16的基础上进一步优化 (Whitman DB, Cox CD, Breslin MJ, et al. ChemMedChem, 2009, 4: 1069−1074)。 5 第二轮的优化—改善药代动力学性质 (从研究代 谢产物入手) 化合物 16 生物利用度低的主要原因是有首过效 应的缘故, 在肝脏中发生氧化代谢而失活。通过 16 与微粒体温孵, 温孵液的氧化产物 (往往是醛酮类化 合物) 用氨基脲捕获羰基化合物, 质谱分析加成物, 得知是二氮䓬的 7 位被氧化成羟基, 开环成醛基而形 成的缩氨脲。二氮䓬开环, 打散了 16 的刚性结构。 苯环上的甲基也可被氧化, 以及喹唑啉的氧化等。如 图 1 所示的代谢位点。 图 1 化合物 16 被氧化代谢的位点 5.1 增加位阻避免代谢—二氮䓬环上引入取代基 阻止氧化代谢的一个方法是在代谢位点附近引入基 团以增加位阻, 为此在二氮䓬的不同位置作不同的 取代。 首先, 成功完成了不同取代的二氮䓬环的合成, 共制备了 15 个单取代和二取代的二氮䓬母核, 通过 通量的合成和活性测试, 证明 2、6 或 7 位引入基团 不仅不影响与受体的结合, 而且还提高了活性强度。 将这些有潜在活性的母核与不同的杂环和 (或) 不 同取代的苯甲酸缩合, 得到了大量目标化合物。生物 学评价分 3 步走: 首先测定对双靶标 Ox1R/Ox2R 的 活性, 然后犬静脉注射测定清除率以评价代谢速率 和程度, 在此基础上评价口服生物利用度。综合评价 化合物的活性、药代和物化性质, 确定了单取代的 7- 甲基二氮䓬为母核, 做进一步优化。 5.2 喹唑啉环上的取代 在合成的化合物中, 有代 表性的化合物 17～19 对两种 Ox1R/Ox2R 受体的结合 力与抑制活性都很高, 然而犬的药代实验表明, 化合 物 17 和 18 的药代性质与 16 相比没有明显改善, 而 6-氟代喹唑啉化合物 19 的生物利用度和清除率都优 于 16, 灌胃引起大鼠同样睡眠的剂量只是化合物 16 的十分之一, 药效高是因药代好之故。表 3 列出了这 些化合物的活性和犬的药代数据。 然而化合物 19 出现新的问题, 即在体内经氧化 代谢生成亲电性基团, 有潜在的毒性。用微粒体与 19 温孵, 加入谷胱甘肽 (GSH) 以捕获亲电试剂, 仪器 检测到了 GSH 加成产物。药物代谢产生亲电性物质, 往往引起特质性毒性反应, 因而化合物 19 不能作为 候选化合物。因此优化的目标又加上了是否会因代谢