3基因到药物的过程 基因到药物的过程其实就是特定基因表达的过程，基因表达的产物要大量、 高纯度。 3.1目的基因的分离和提取 3.1.1从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需要某 一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色 体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 3.1.2化学合成法：己知目的基因的核苷酸序列，可用DNA合成仪直接合成。 3.1.3用PCR技术扩增技术提取。己知目的基因引物的序列，将整个DNA放入合成仪，因为 只有当引物与模板结合后DNA热聚合酶才能行使聚合功能，所以只有引物中间的目的基因被 大量扩增，即被提取出来。 3.2目的基因与载体结合构建重组体 3.2.1质粒DNA的分离纯化：一般含有单个目的基因的DNA片段，即使进入了宿主细胞也不 能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA分子（例如质粒、噬菌体DNA等）结 合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。 分离质粒载体DNA有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养 物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS),使其发生温和的溶菌作用。这样质粒 DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染 色体的DNA则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所 得的含有质粒DNA的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的DNA混合物中，质粒DNA( cccDNA)呈超螺旋状态。为进一步纯化出CccDNA分子，可在含有溴化乙锭(EB)染料和氯 化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA分子的两个相邻碱 基对之间，从而降低了DNA分子在氯化铯中的密度。又由于CCcDNA同EB的结合能力比开环 DNA和线性DNA低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将CCcDNA同其他两种类型的 DNA分离开来其他载体DNA分高纯化的原理与上述类似。 3.2.2目的基因与载体的连接。外源DNA片段与载体DNA分子的连接，即DNA分子的体外重 组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。在进行连接时，一般需要注意以下 几点：①实验步骤尽可能简单容易：②在连接后，接点序列能被一定的限制酶重新酶切 ，以便回收插入片段：③对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 3.3重组体导入宿主细胞 3.3.1转化法：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。原生质体转化法：除去细胞壁 后加外源DNA,经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。化学转化法：将对数生长期的细菌在0 摄氏度下，用遇冷的氯化钙溶液低渗处理，以使菌体的细胞壁和细胞膜的通透性增加，菌体 膨胀成球形，DNA易于进入细菌的细胞内。电穿孔法：利用高压脉冲电场，在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔，质粒DNA可乘隙而入，在脉冲过后，微孔复原。 3.3.2通过接合作用传递质粒DNA:F质粒，除了含有自我复制基因外，还带有一套接合转移 的基因，凡携有F质粒的菌株称F+菌株。 3.3.3通过转染、转导作用传递质粒DNA。转染：病毒DNA及其重组子DNA导入宿主细胞( 或细菌)的过程称转染。转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。3 基因到药物的过程 基因到药物的过程其实就是特定基因表达的过程，基因表达的产物要大量、 高纯度。 3.1 目的基因的分离和提取 3.1.1 从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多 DNA 片段，导入 受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需要某 一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色 体上的位置、基因的转录产物 mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 3.1.2 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列，可用 DNA 合成仪直接合成。 3.1.3 用 PCR 技术扩增技术提取。已知目的基因引物的序列，将整个 DNA 放入合成仪，因为 只有当引物与模板结合后 DNA 热聚合酶才能行使聚合功能，所以只有引物中间的目的基因被 大量扩增，即被提取出来。 3.2 目的基因与载体结合构建重组体 3.2.1 质粒 DNA 的分离纯化：一般含有单个目的基因的 DNA 片段，即使进入了宿主细胞也不 能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的 DNA 分子（例如质粒、噬菌体 DNA 等）结 合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。 分离质粒载体 DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养 物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如 SDS），使其发生温和的溶菌作用。这样质粒 DNA 、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA 等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染 色体的 DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所 得的含有质粒 DNA 的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的 DNA 混合物中，质粒 DNA （ cccDNA ）呈超螺旋状态。为进一步纯化出 cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯 化铯溶液中进行密度梯度离心。EB 是一种扁平分子，它能插入双链 DNA 分子的两个相邻碱 基对之间，从而降低了 DNA 分子在氯化铯中的密度。又由于 cccDNA 同 EB 的结合能力比开环 DNA 和线性 DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将 cccDNA 同其他两种类型的 DNA 分离开来其他载体 DNA 分高纯化的原理与上述类似。 3.2.2 目的基因与载体的连接。外源 DNA 片段与载体 DNA 分子的连接，即 DNA 分子的体外重 组，主要依赖于限制性内切核酸酶及 DNA 连接酶的作用。在进行连接时，一般需要注意以下 几点：① 实验步骤尽可能简单容易；② 在连接后，接点序列能被一定的限制酶重新酶切 ，以便回收插入片段；③ 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 3.3 重组体导入宿主细胞 3.3.1 转化法：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。原生质体转化法：除去细胞壁 后加外源 DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。化学转化法：将对数生长期的细菌在 0 摄氏度下，用遇冷的氯化钙溶液低渗处理，以使菌体的细胞壁和细胞膜的通透性增加，菌体 膨胀成球形，DNA 易于进入细菌的细胞内。电穿孔法：利用高压脉冲电场，在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔，质粒 DNA 可乘隙而入，在脉冲过后，微孔复原。 3.3.2 通过接合作用传递质粒 DNA：F 质粒，除了含有自我复制基因外，还带有一套接合转移 的基因，凡携有 F 质粒的菌株称 F＋菌株。 3.3.3 通过转染、转导作用传递质粒 DNA。转染：病毒 DNA 及其重组子 DNA 导入宿主细胞（ 或细菌）的过程称转染。转导：以噬菌体为媒介，将外源 DNA 导入细菌的过程称转导