3.在柱中注入洗脱液(约1/3柱床高度),将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中,待凝胶沉 积约1cm~2cm高度后打开出水口,流速一般用3m1~6m1/10min。胶面上升到柱 记号处则装柱完毕,注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口,静置片刻,等 凝胶完全沉降,则接上恒流泵,用1~2倍床体积的洗脱液平衡柱子,使柱床稳定。 (三)V的测定 吸去柱上端的洗脱液(切不要搅乱胶面,可复盖一张滤纸或尼龙网)。打开出水 口,使残余液体降至与胶面相切(但不要干胶),关闭出水口。用细滴管吸取0.5ml (2mg/m1)蓝色葡聚糖一2000,小心地绕柱壁一圈(距胶面2mm)缓慢加入,然后迅速 移至柱中央慢慢加入柱中,打开出水口(开始收集!),等溶液滲入胶床后,关闭出 水口,用少许洗脱液加入柱中,渗入胶床后,柱上端再用洗脱液充满后用3m1/10分钟 的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚 糖浓度最高点的洗脱液体积即为V。注意:蓝色葡聚糖洗下来之后,还要用洗脱液(1 2倍床体积)继续平衡一段时间,以备下步实验使用 (四)标准曲线的制作 1.用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用,溶液中四种蛋白的浓度各为:牛血清清蛋 白(2.5mg/m1)、鸡卵清清蛋白(6.0mg/m1)、胰凝乳蛋白酶原A(2.5ng/m1)和溶菌 酶(2.5mg/m1)。 2.按(三)的操作方法加入上述标准蛋白溶液(0.5m1~1m1),以1.5ml/管/5分 钟的速度洗脱并收集洗脱液 3.用紫外分光光度计逐管测定A38,并确定各种蛋白的洗脱峰最高点,然后量出各 种蛋白的洗脱体积ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液,量比较少,因此比色时要加 入一定量的洗脱液进行测定。(一般的比色杯可以盛装3ml溶液)。当然,也可以用微 量比色杯进行测定 4.以A30为纵座标,Ve为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。 5.以Kav为纵座标, logO为横座标作图画出一条标准曲线。 6.以Ve为纵座标, logMw为横座标作图画出一条标准曲线。 (五)未知蛋白分子量的测定 测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3.步相同,然后在标准曲线上查得1ogMw,其反对 数便是待测蛋白质的分子量 注意:实验完毕后,将凝胶全部回收处理,以备下次实验使用,严禁将凝胶丢弃 或倒入水池中。 参考文献 1.李建武等,《生物化学实验原理和方法》1994年 2.赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年 3. ROBERTL drYer GENEF LATA <EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY 1989 18183 3. 在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉 积约1cm ～ 2cm 高度后打开出水口，流速一般用3ml～6ml / 10 min。胶面上升到柱 记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等 凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 （三）V0的测定 吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可复盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水 口，使残余液体降至 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取０.5 ml （2mg/ml）蓝色葡聚糖—2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入,然后迅速 移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出 水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗 脱液充满后用3ml/10分钟 的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚 糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（１～ ２倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。 （四）标准曲线的制作 1. 用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用，溶液中四种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋 白（2.5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（6.0mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶菌 酶（2.5mg/ml）。 2. 按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分 钟的速度洗脱并收集洗脱液。 3. 用紫外分光光度计逐管测定 A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各 种蛋白的洗脱体积 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液，量比较少，因此比色时要加 入一定量的洗脱液进行测定。（一般的比色杯可以盛装3ml溶液）。当然，也可以用微 量比色杯进行测定。 4. 以 A280 为纵座标，Ve 为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。 5. 以 Kav 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。 6. 以 Ve 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。 （五）未知蛋白分子量的测定 测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3. 步相同，然后在标准曲线上查得logMw,其反对 数便是待测蛋白质的分子量。 注意： 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃 或倒入水池中。 参考文献 1. 李建武等，《生物化学实验原理和方法》1994年 2. 赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年 3. ROBERTL.DRYER & GENEF.LATA 《EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY》1989