)具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建 Bloch最早证实细胞内的GSH是由γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I,EC6,3,2.2)与谷胱甘 肽合成酶( GSH-Il,EC6.323)在ATP存在下催化L谷氨酸(Gu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly) 的一个序贯反应合成的。要实现GSH的高效合成,GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给 是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌wsH-KE1能以葡萄糖为底物在胞内积累GSH。虽然 可以实现该菌株的高密度培养,但由于质粒的不稳定性,使得该菌株在高密度培养过程中胞 内GSH合成能力明显下降 在经过细胞通透性处理之后,重组大肠杆菌 WSH-KE能够以L-Glu,LCys和Gly为底物, 在胞外积累1g/L左右的GSH。然而,在该菌株中,质粒稳定性极差。考虑到工程菌中外来 基因的表达既受基因本身的影响,也受宿主细胞遗传及生理特性的影响,为此,我们改变宿 主细胞,试图构建一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。在此基础上,对新 构建菌株生物合成GSH的反应过程进行了研究 质粒pGH501的提取和大肠杆菌转化 携带质粒pGH501的重组E. coli wsh-KE1能够以葡萄糖为底物胞内积累GSH,然而在高 密度培养条件下质粒容易丢失。Aiba等和 Skogman等认为,质粒的稳定性会受到宿主细胞遗 传特性、质粒的拷贝数以及质粒上基因的表达等诸多因素的影响。因此,更换质粒pGH501 的宿主细胞,有可能构建出一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌 首先从重组E. coli wsh-Ke1中提取质粒pGH501,然后分别以E. coli dh5a、E.col JM09、E.colI和Ecol.宿主进行转化,以氨苄青霉素抗性(Amp为选择性标记挑取转 化子。在所得到的不同宿主的转化子中,各选取10个生长情况良好的单菌落,考察其GSH 合成能力。结果发现,新构建的转化子中,80%以上其GSH合成能力较出发菌株有所提高 表3-2-1给出了部分转化子的GSH合成活性比较。根据初筛结果,从不同宿主细胞中分别选 取GSH合成能力最强的4株菌进行复筛,结果以E. coliN5a和E. colijN109为宿主细胞获得的 转化子,其GSH合成能力明显下降(甚至低于出发菌株),而以野生型大肠杆菌为宿主细胞获 得的转化子E. coli I-2和 E. coliⅡ-1,却仍能保持很强的GSH合成活性。分别从这两个转化子 中提取质粒,琼脂糖凝胶电泳证实质粒pGH501已成功转入11 (一)具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建 Bloch最早证实细胞内的GSH是由-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I，EC6.3.2.2)与谷胱甘 肽合成酶(GSH-II，EC6.3.2.3)在ATP存在下催化L-谷氨酸(Glu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly) 的一个序贯反应合成的。要实现GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给 是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌WSH-KE1能以葡萄糖为底物在胞内积累GSH。虽然 可以实现该菌株的高密度培养，但由于质粒的不稳定性，使得该菌株在高密度培养过程中胞 内GSH合成能力明显下降。 在经过细胞通透性处理之后，重组大肠杆菌WSH-KE1能够以L-Glu，L-Cys和Gly为底物， 在胞外积累1 g/L左右的GSH。然而，在该菌株中，质粒稳定性极差。考虑到工程菌中外来 基因的表达既受基因本身的影响，也受宿主细胞遗传及生理特性的影响，为此，我们改变宿 主细胞，试图构建一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。在此基础上，对新 构建菌株生物合成GSH的反应过程进行了研究。 1、质粒pGH501的提取和大肠杆菌转化 携带质粒pGH501的重组E. coli WSH-KE1能够以葡萄糖为底物胞内积累GSH，然而在高 密度培养条件下质粒容易丢失。Aiba等和Skogman等认为，质粒的稳定性会受到宿主细胞遗 传特性、质粒的拷贝数以及质粒上基因的表达等诸多因素的影响。因此，更换质粒pGH501 的宿主细胞，有可能构建出一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。 首先从重组E. coli WSH-KE1中提取质粒pGH501，然后分别以E. coli DH5、E. coli JM109、E. coliⅠ和E. coliⅡ为宿主进行转化，以氨苄青霉素抗性(Ampr )为选择性标记挑取转 化子。在所得到的不同宿主的转化子中，各选取10个生长情况良好的单菌落，考察其GSH 合成能力。结果发现，新构建的转化子中，80%以上其GSH合成能力较出发菌株有所提高。 表3-2-1给出了部分转化子的GSH合成活性比较。根据初筛结果，从不同宿主细胞中分别选 取GSH合成能力最强的4株菌进行复筛，结果以E. coliDH5和E. coliJM109为宿主细胞获得的 转化子，其GSH合成能力明显下降(甚至低于出发菌株)，而以野生型大肠杆菌为宿主细胞获 得的转化子E. coliⅠ-2和E. coliⅡ-1，却仍能保持很强的GSH合成活性。分别从这两个转化子 中提取质粒，琼脂糖凝胶电泳证实质粒pGH501已成功转入