闫海等：小球藻的筛选和异养培养 ·409· Vol.27 No.4 酸钾取代，同时去除了水生4号培养基)中的无 类的生长，当藻类浓度大时，需稀释后测定，使测 机碳源碳酸氢钠，添加葡萄糖作为支持小球藻生 定值在0.10.4的线性关系，再根据稀释倍数计算 长的惟一有机碳源.培养基初始pH都调至7.0左 出藻细胞浓度.同时测定藻类培养物的pH,以确 右，按每100mL溶液中加入1g琼脂粉的比例加 定藻类批量培养的优化控制条件， 入琼脂后，可制备出对应的固体培养基 1.3实验条件 2结果与讨论 光照静置培养主要用于异养小球藻种的筛 2.1小球藻的筛选和识别 选，所用实验器皿为100mL玻璃三角瓶，培养量 图1是在固体培养基上长出的筛选小球藻单 20mL.培养温度30℃，12h光照黑暗循环，光照 克隆菌落，其特点是藻菌落较大，颜色深绿.图2 强度3000x.异养批量培养在摇床内进行，无光 是在显微镜下观察小球藻细胞形态的显微照片， 照，摇床转速为200r~min,温度30℃，所用实验 图中显示筛选小球藻细胞圆形，单独存在，细胞 器皿和培养量与光照培养条件相同.实验用器皿 中间有一个明显的载色体，因此初步确定筛选的 和配制的培养基均经20min,124℃的高温高压和 藻种为小球藻.图3是此筛选小球藻分别在光照 20min紫外灯照射的灭菌后使用. 自养和批量异养培养条件下培养4d后的照片， 1.4小球藻种的筛选 虽然此小球藻在自养和异养条件下都能够生长， 2004年5月取北京清河含绿藻的河水50mL, 但异养批量培养出的小球藻颜色深绿，细胞浓度 先用滤纸过滤去除大型颗粒物后将滤液放入离 明显高于光照自养培养下的小球藻细胞浓度， 心管内，在10000rmin下离心10min.倒净上清 液，加入10mL经高温高压灭菌的水生4号培养 基，经振荡使藻细胞悬浮，再经离心后倒去上清 液.按照上述清洗藻细胞步骤重复三次后，取1 mL藻悬浮液于培养基中先进行光照培养，培养 5d后取样1mL再重新接种于新鲜培养基中进行 光照培养，重复光照培养三次后，取1mL培养物 接种于含有10gL葡萄糖的培养基中进行光照 培养，5d后再取1mL培养物重新接种于相同的 培养基中，重复培养3次后，将培养物用含葡萄 图1筛选小球藻的单克隆藻菌落 糖的培养基稀释不同倍数后涂抹于固体培养基 Fig.1 Single clone strain of isolated Chlorella sp 上，光照培养7d后挑取深绿色单克隆藻菌落接 种于液体培养基中进行黑暗条件下的异养批量 培养，以在批量培养条件下藻类是否能够生长来 识别筛选藻种是否具有异养能力，采用此种方 法，成功筛选出一株能够在黑暗条件下生长于葡 萄糖的小球藻种 1.5研究方法 10m 在葡萄糖作为藻类生长惟一碳源的情况下， 图2显微镜下筛选小球藻的细胞形态 分别研究了不同含氮化合物对筛选小球藻生长 Fig.2 Conformation of Chlorella sp cells under a microscope 的效应.在研究确定出能够支持小球藻生长氯源 的基础上，更进一步研究了不同碳氮比对小球藻 目前国内外在异养培养小球藻方面进行了 生长的效应.实验前分别测定了藻液在680nm下 大量研究，一般认为在异养培养过程中，由于小 的吸光度(ODmm)和藻细胞的干重浓度，并在显 球藻叶绿素含量降低，使细胞颜色黄化，而笔 微镜下用血球计数板计数换算出了藻细胞浓度， 者筛选的小球藻即使在无光照异养批量培养条 建立了ODam分别与藻细胞浓度和藻细胞干重 件下，其颜色仍然保持墨绿（图3），说明此小球藻 浓度的线性关系.实验中直接测定OD0m以示藻 在有无光照条件下对其细胞色素合成的影响不￾匕￾ 一￾￾￾￾ ￾￾ 闰 海 等 ￾ 小 球藻 的 筛选和 异养 培养 一 ￾￾￾ ￾ 酸 钾 取 代 ， 同 时去 除 了水 生 ￾ 号培 养 基 〔￾，中 的无 机 碳源碳 酸 氢 钠 ， 添 加 葡 萄糖作 为支持 小球 藻 生 长 的惟 一 有机 碳 源 ￾ 培 养 基 初 始 ￾￾ 都调 至 ￾￾左 右 ， 按 每 ￾￾￾￾ 溶液 中加 入 ￾￾琼 脂粉 的 比例 加 入 琼脂 后 ， 可 制 备 出对 应 的 固体培 养基 ￾ ￾￾ 实验 条件 光 照 静 置 培 养 主 要 用 于 异 养 小 球 藻 种 的筛 选 ， 所 用 实验 器 皿 为 ￾￾￾￾ 玻 璃 三 角 瓶 ， 培 养 量 ￾ ￾￾ ￾ 培 养温 度 ￾℃ ， ￾ ￾光 照 黑 暗循 环 ， 光 照 强度 ￾￾￾ ￾ ￾ 异 养 批 量 培 养 在 摇 床 内进 行 ， 无 光 照 ， 摇床 转速 为 ￾￾ ￾ · ￾￾ 一 ，， 温 度 ￾℃ ， 所 用 实验 器 皿和 培养 量 与 光 照 培养 条件 相 同 ￾ 实验 用器 皿 和 配 制 的培 养基 均 经 ￾ ￾￾ ， ￾￾℃ 的高温 高压 和 ￾￾￾￾刃￾ 紫 外 灯 照 射 的灭 菌 后 使用 ￾ ￾ ￾￾ 小球 藻 种 的筛 选 ￾￾ 年 ￾月 取 北 京清河 含绿藻 的河水 ￾ ￾ ￾ ， 先 用 滤 纸 过 滤 去 除 大 型 颗 粒 物 后 将 滤 液 放 入 离 心 管 内 ， 在 ￾￾￾￾ ￾ · ￾￾ 一 ，下 离心 ￾ ￾￾ ￾ 倒 净 上 清 液 ， 加 入 ￾ ￾￾ 经 高温 高压 灭 菌 的水 生 ￾号 培 养 基 ， 经 振 荡 使 藻 细 胞悬 浮 ， 再 经 离 心 后 倒 去 上清 液 ￾ 按 照 上 述清 洗藻 细 胞 步 骤 重 复 三 次 后 ， 取 ￾ ￾￾ 藻 悬 浮 液 于培 养 基 中先 进 行光 照 培 养 ， 培 养 ￾￾后 取 样 ￾￾￾再 重新 接 种 于 新鲜 培 养 基 中进 行 光 照 培 养 ， 重 复光 照 培 养 三 次 后 ， 取 ￾￾ ￾培 养物 接种 于含 有 ￾￾￾’￾ 一 ，葡 萄糖 的培 养基 中进 行光 照 培 养 ， ￾￾后 再 取 ￾￾￾￾ 培 养 物 重 新 接 种 于 相 同 的 培养 基 中 ， 重 复培 养 ￾次后 ， 将 培 养物用 含葡 萄 糖 的培 养 基 稀 释 不 同倍 数 后 涂 抹 于 固体 培 养基 上 ， 光 照 培 养 ￾￾后 挑 取 深 绿色 单 克 隆藻 菌 落 接 种 于 液 体 培 养 基 中进 行 黑 暗 条 件 下 的异 养 批 量 培养 ， 以在 批 量 培养条件 下 藻 类 是 否 能够 生 长 来 识别 筛 选 藻 种 是 否 具 有 异 养 能 力 ￾ 采 用 此 种 方 法 ， 成 功筛选 出一株 能够 在黑 暗条件 下 生长 于葡 萄糖 的 小 球 藻种 ￾ ￾￾ 研 究方 法 在 葡 萄 糖 作 为藻类 生 长 惟 一碳源 的情 况 下 ， 分 别研 究 了 不 同含 氮 化 合 物 对 筛 选 小 球 藻 生 长 的效应 ￾ 在研 究确 定 出能够 支 持 小球 藻 生 长氮源 的基础 上 ， 更 进 一 步研 究 了不 同碳 氮 比对 小球 藻 生 长 的效应 ￾ 实验前 分 别 测定 了藻 液在 ￾￾ ￾ 下 的吸 光 度 ￾￾‘￾。 动 和 藻 细 胞 的干 重 浓 度 ， 并在显 微镜 下用 血 球 计数 板 计数 换算 出 了藻 细 胞 浓 度 ， 建立 了 ￾￾ ￾吕。 。 分 别 与 藻 细 胞 浓 度和 藻 细 胞 干 重 浓 度 的线 性关 系 ￾ 实验 中直接测 定 ￾￾ ￾。 二 以示 藻 类 的生 长 ， 当藻类 浓度 大 时 ， 需稀释 后 测 定 ， 使测 定值 在 ￾ ￾ ￾一￾￾的线 性关系 ， 再 根据 稀 释倍 数计算 出藻 细 胞 浓 度 ￾ 同 时测 定 藻类 培 养 物 的￾￾ ， 以确 定藻类批 量 培 养 的优 化 控 制 条件 ￾ ￾ 结 果 与 讨 论 ￾ ￾ ￾ 小 球 藻 的筛 选 和 识 别 图 ￾是在 固体培养基 上长 出的筛选 小球 藻单 克 隆菌 落 ， 其特 点是藻 菌落 较 大 ， 颜 色 深 绿 ￾ 图 ￾ 是 在显 微 镜 下观 察 小球 藻细 胞 形 态 的显微 照 片 ， 图 中显 示 筛 选 小球 藻 细 胞 圆形 ， 单 独 存 在 ， 细 胞 中 间有 一个 明显 的载色 体 ， 因此初 步确 定筛选 的 藻种 为 小 球 藻 ￾ 图 ￾是 此 筛选 小球 藻 分 别在 光 照 自养 和 批 量 异养培养 条 件 下培 养 ￾ ￾后 的照 片 ， 虽 然 此 小球 藻在 自养和 异养 条件下 都 能够 生长 ， 但异 养 批量 培养 出 的小 球藻颜色深 绿 ， 细 胞浓度 明显 高 于 光 照 自养 培 养 下 的 小球 藻 细 胞浓 度 ￾ 图 ￾ 筛选小球藻的 单克隆 藻菌落 ￾啥￾ ￾￾沙 ￾￾￾￾ ￾￾￾￾￾ ￾￾￾￾￾记 ￾￾￾￾￾￾坦￾ ￾￾ 图 ￾ 显 微镜下 筛 选小 球藻 的细胞 形 态 ￾￾ ￾￾ ￾￾￾￾￾ ￾幼￾￾ ￾￾￾￾￾￾￾ ，￾ ￾￾￾￾ ￾ ￾￾￾￾ ￾ ￾￾￾￾￾￾￾￾￾ 目前 国 内外 在 异 养 培 养 小 球 藻 方 面 进 行 了 大 量研 究 ， 一般 认 为在 异 养 培 养 过 程 中 ， 由于 小 球 藻 叶绿 素 含 量 降低 ， 使 细 胞 颜色 黄 化 ‘￾￾，， 而 笔 者 筛 选 的小 球 藻 即 使在 无 光 照 异 养 批 量 培 养 条 件 下 ， 其颜色 仍 然 保 持墨绿 ￾图 ￾ ， 说 明此 小球 藻 在 有 无 光 照 条件 下 对 其 细 胞 色 素 合 成 的影 响 不