D0I:10.13374/i.issn1001-053x.2005.01.006 第27卷第4期 北京科技大学学报 Vol.27 No.4 2005年8月 Journal of University of Science and Technology Beijing Aug.2005 小球藻的筛选和异养培养 闫海)周洁)何宏胜)魏玉霞)孙建新) 1)北京科技大学应用学院，北京1000832)广东绿百多生物科技有限公司，湛江524017 摘要从北京清河筛选出了具有异养能力的一株藻类，经初步鉴定为小球藻，在异养批量 培养条件下，研究了不同氮源和碳氮比对筛选小球藻生长的效应.当葡萄糖作为惟一碳源时， 硝酸钾和尿素都可以分别作为惟一氯源支持小球藻快速持续生长，而氯化铵作为惟一氨源 时因使培养物中的快速降低而抑制了小球藻的进一步生长.当葡萄糖和硝酸钾分别作为 小球藻生长的惟一碳源和氨源时，在碳氨质量比从5到20范围内，小球藻的生长随碳氮质量 比的升高而明显增加，最大ODam达到了73.8. 关键词小球藻：筛选：异养培养：碳源：氮源 分类号Q949.21 微细藻类作为最简单的光合作用有机体，是 种方法，一般培养出的藻细胞浓度较低.20世纪 地球生命起源的先锋物种之一，已有20多亿年 70年代以来，国外学者发现，有些小球藻可以在 的历史，小球藻是绿藻小球藻科的一个重要属， 无光照条件下生长于有机物”，不仅大幅度提高 包括大约10个种，细胞形态圆形或椭圆形，细胞 了小球藻的生长速度，而且获得了很大的藻生物 直径2~12m.小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪 量，从而引起了单胞藻类培养的一次重要革命. 酸、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素，具有极 虽然国外和我国香港学者在利用异养培养的小 高的营养价值和提高免疫力的功能，被FAO列为 球藻生产人类健康食品和叶黄素方面进行了大 21世纪人类的健康食品.另外更重要的是小球藻 量的研究，但因为真正能够异养快速生长的小 还含有一种非常重要的成分叫做小球藻促进生 球藻种类比较稀少，我国目前研究使用的小球 长因子，它既具有诱发干扰素，激发人体防御和 藻种大多由香港学者陈峰赠送.因此有必要在 免疫组织中的巨噬细胞、T细胞和B细胞的功能， 大陆依据现有的实验条件和研究能力，筛选出具 又具有促进对可能污染环境的有害物质解毒和 有我国自主知识产权能够异养生长的小球藻种， 排泄的作用.近两年来，日本生产的小球藻片已 通过培养条件的研究，获得超高细胞浓度的小球 经开始出口中国，经有关部门的功能实验证明， 藻，为我国藻类生物科技的发展做出贡献. 该产品具有很强的免疫调节保健功能，在环境科 学领域，研究结果表明小球藻具有降解邻苯二甲 1实验材料与研究方法 酸酯类)和吸附重金属铜的能力，在去除水中 1.1实验藻种 有机污染物和重金属方面具有重要作用.目前， 实验所用的小球藻是2004年5月从北京清 单胞藻类在健康食品、细胞色素生产、环境污染 河水中筛选出的纯藻种，在无光照条件下此小球 治理和水产养殖等领域得到了广泛应用. 藻可以快速生长于有机物，具有非常强的异养培 一般认为微细藻类属于低等植物，主要吸收 养潜力， 二氧化碳通过光合作用合成有机物可，但采用此 1.2培养基 收稿日期：2004-11-17修回日期：200502-22 光照静置实验用水生4号培养基，在筛选异 基金项目：国家自然科学基金No.30270277,No.20377047)和 养小球藻过程中加入10gL的葡萄糖作为有机 北京科技大学422高级引进人才及校重点基金QN0.20050604 190)资助项目 碳源.在无光照批量异养培养实验时，将水生4 作者简介：闫海(1962一，男，教授 号培养基中的硫酸铵分别用氯化铵、尿素和硝
第 卷 第 期 年 月 北 京 科 技 大 学 学 报 勿 恤 小球藻的筛选和异养培养 闰 海 ‘， 周 洁 ” 何宏 胜 ” 魏 玉 霞 ” 孙 建新 ” 北 京科 技大 学 应 用 学 院 ， 北 京 广东绿 百 多生 物 科技 有 限 公 司 ，湛江 摘 要 从 北 京 清河筛选 出 了具 有异养 能力 的一株藻类 ， 经初 步鉴 定为小球藻 在异养 批量 培养条件 下 ， 研究 了不 同氮源和 碳氮 比对 筛选小球藻生长 的效应 当葡 萄糖作 为惟 一碳源 时 ， 硝 酸钾 和 尿 素 都可 以分 别 作 为惟 一氮源 支持 小球藻 快速持续 生 长 ， 而 氯化 钱作 为惟一 氮源 时 因 使 培养物 中的 快 速 降低 而抑 制 了小球 藻 的进 一 步生 长 当葡 萄糖和 硝 酸 钾分别 作为 小球藻 生 长 的惟 一碳 源 和 氮源 时 ， 在碳氮 质量 比 从 到 范 围 内 ， 小球 藻 的生 长 随碳氮 质量 比 的升 高而 明 显 增加 ， 最 大 二 达到 了 关键词 小球藻 筛选 异 养培养 碳源 氮源 分 类号 微 细 藻类 作 为最 简单 的光 合 作 用 有 机体 ， 是 地 球 生命 起 源 的先锋 物 种 之 一 ， 已 有 多亿 年 的历 史 小球 藻 是 绿 藻 小球 藻 科 的一个 重要 属 ， 包 括大 约 个 种 ， 细 胞 形态 圆形或 椭 圆形 ， 细 胞 直 径 一 脚 小球 藻 富含 蛋 白质 、 不 饱 和 脂 肪 酸 、 类 胡萝 卜素 、 虾青素 和 多种维 生素‘， ， 具有极 高的营养价值和 提 高免疫 力 的功 能 ， 被 列 为 世 纪人类 的健康食 品 另外 更重 要 的是 小球藻 还 含 有 一 种 非 常 重 要 的成 分 叫做 小 球 藻 促 进 生 长 因子 ， 它 既具 有 诱 发干 扰 素 ， 激 发 人 体 防御 和 免疫组 织 中 的 巨噬细 胞 、 细胞 和 细胞 的功 能 ， 又 具 有 促 进 对 可 能 污 染 环 境 的有 害物 质 解 毒 和 排 泄 的作 用 近 两 年 来 ， 日本 生产 的小球 藻 片 已 经 开始 出 口 中 国 ， 经 有 关 部 门的 功 能 实验 证 明 ， 该产 品具有很 强 的免疫 调节 保健 功 能 在 环 境科 学领 域 ， 研 究 结果表 明小球 藻 具 有 降解邻 苯 二 甲 酸 酷 类 。，和 吸 附重 金 属 铜 “，的能 力 ， 在 去 除水 中 有机污 染物和 重 金 属 方 面 具 有 重要 作 用 目前 ， 单 胞 藻类在 健 康 食 品 、 细 胞 色 素 生产 、 环 境 污 染 治理 和水 产养殖 等 领 域 得 到 了广 泛 应 用 一般认 为微 细 藻类 属 于低 等植物 ， 主要 吸 收 二氧 化碳 通 过 光 合 作 用 合 成 有机 物 “，， 但 采用 此 收稿 日期 今一 修回 日期 一一 基金项 目 国家 自然 科学 基金 困 和 北 京科技大学 高级 引进 人才 及校重 点基金 困。 资助 项 目 作者简 介 闰海 一 ， 男 ， 教授 种方 法 ， 一 般 培养 出 的藻 细 胞 浓 度 较低 加 世 纪 年代 以来 ， 国外 学 者 发现 ， 有 些 小球 藻 可 以在 无 光 照 条件 下 生长 于有机 物环， ， 不 仅大幅度 提 高 了小球藻 的生长速度 ， 而 且获 得 了很 大 的藻 生物 量 ， 从而 引起 了单 胞 藻 类 培 养 的一 次 重 要 革 命 虽 然 国外 和 我 国香 港 学 者 在 利 用 异养 培 养 的 小 球 藻 生 产 人 类 健 康 食 品和 叶 黄 素 方 面 进 行 了大 量 的研 究 ‘， ， 但 因为真 正 能够 异养 快速 生长 的小 球 藻 种 类 比较稀 少 ‘ ， 我 国 目前 研 究使 用 的小球 藻 种 大 多 由香港 学者 陈 峰赠 送 ‘，” 因此 有 必 要 在 大 陆依据现 有 的实验条 件和 研 究 能力 ， 筛选 出具 有我 国 自主 知识 产权 能够 异养生 长 的小球 藻种 通过培 养条件 的研 究 ， 获得超 高细 胞浓度 的小球 藻 ， 为我 国藻类 生物 科技 的发展 做 出贡 献 实验 材 料 与研 究方 法 实验 藻 种 实验 所 用 的小 球 藻 是 年 月从 北 京清 河 水 中筛选 出 的纯 藻种 ， 在 无光 照条件 下 此 小球 藻 可 以快速 生 长 于有机 物 ， 具 有 非常 强 的异养 培 养 潜 力 培养 基 光 照静 置 实验 用 水 生 号培养基周 ， 在筛选 异 养 小球 藻 过程 中加 入 · 一 ‘的葡 萄糖 作 为 有机 碳 源 在 无 光 照 批 量 异 养 培养 实验 时 ， 将 水 生 号培 养 基 【 中 的硫 酸钱 分 别 用 氯化 钱 、 尿 素 和 硝 ＤＯＩ：１０．１３３７４／ｊ．ｉｓｓｎ１００１－０５３ｘ．２００５．０４．００６
闫海等：小球藻的筛选和异养培养 ·409· Vol.27 No.4 酸钾取代，同时去除了水生4号培养基)中的无 类的生长，当藻类浓度大时，需稀释后测定，使测 机碳源碳酸氢钠，添加葡萄糖作为支持小球藻生 定值在0.10.4的线性关系，再根据稀释倍数计算 长的惟一有机碳源.培养基初始pH都调至7.0左 出藻细胞浓度.同时测定藻类培养物的pH,以确 右，按每100mL溶液中加入1g琼脂粉的比例加 定藻类批量培养的优化控制条件， 入琼脂后，可制备出对应的固体培养基 1.3实验条件 2结果与讨论 光照静置培养主要用于异养小球藻种的筛 2.1小球藻的筛选和识别 选，所用实验器皿为100mL玻璃三角瓶，培养量 图1是在固体培养基上长出的筛选小球藻单 20mL.培养温度30℃，12h光照黑暗循环，光照 克隆菌落，其特点是藻菌落较大，颜色深绿.图2 强度3000x.异养批量培养在摇床内进行，无光 是在显微镜下观察小球藻细胞形态的显微照片， 照，摇床转速为200r~min,温度30℃，所用实验 图中显示筛选小球藻细胞圆形，单独存在，细胞 器皿和培养量与光照培养条件相同.实验用器皿 中间有一个明显的载色体，因此初步确定筛选的 和配制的培养基均经20min,124℃的高温高压和 藻种为小球藻.图3是此筛选小球藻分别在光照 20min紫外灯照射的灭菌后使用. 自养和批量异养培养条件下培养4d后的照片， 1.4小球藻种的筛选 虽然此小球藻在自养和异养条件下都能够生长， 2004年5月取北京清河含绿藻的河水50mL, 但异养批量培养出的小球藻颜色深绿，细胞浓度 先用滤纸过滤去除大型颗粒物后将滤液放入离 明显高于光照自养培养下的小球藻细胞浓度， 心管内，在10000rmin下离心10min.倒净上清 液，加入10mL经高温高压灭菌的水生4号培养 基，经振荡使藻细胞悬浮，再经离心后倒去上清 液.按照上述清洗藻细胞步骤重复三次后，取1 mL藻悬浮液于培养基中先进行光照培养，培养 5d后取样1mL再重新接种于新鲜培养基中进行 光照培养，重复光照培养三次后，取1mL培养物 接种于含有10gL葡萄糖的培养基中进行光照 培养，5d后再取1mL培养物重新接种于相同的 培养基中，重复培养3次后，将培养物用含葡萄 图1筛选小球藻的单克隆藻菌落 糖的培养基稀释不同倍数后涂抹于固体培养基 Fig.1 Single clone strain of isolated Chlorella sp 上，光照培养7d后挑取深绿色单克隆藻菌落接 种于液体培养基中进行黑暗条件下的异养批量 培养，以在批量培养条件下藻类是否能够生长来 识别筛选藻种是否具有异养能力，采用此种方 法，成功筛选出一株能够在黑暗条件下生长于葡 萄糖的小球藻种 1.5研究方法 10m 在葡萄糖作为藻类生长惟一碳源的情况下， 图2显微镜下筛选小球藻的细胞形态 分别研究了不同含氮化合物对筛选小球藻生长 Fig.2 Conformation of Chlorella sp cells under a microscope 的效应.在研究确定出能够支持小球藻生长氯源 的基础上，更进一步研究了不同碳氮比对小球藻 目前国内外在异养培养小球藻方面进行了 生长的效应.实验前分别测定了藻液在680nm下 大量研究，一般认为在异养培养过程中，由于小 的吸光度(ODmm)和藻细胞的干重浓度，并在显 球藻叶绿素含量降低，使细胞颜色黄化，而笔 微镜下用血球计数板计数换算出了藻细胞浓度， 者筛选的小球藻即使在无光照异养批量培养条 建立了ODam分别与藻细胞浓度和藻细胞干重 件下，其颜色仍然保持墨绿（图3），说明此小球藻 浓度的线性关系.实验中直接测定OD0m以示藻 在有无光照条件下对其细胞色素合成的影响不
匕 一 闰 海 等 小 球藻 的 筛选和 异养 培养 一 酸 钾 取 代 ， 同 时去 除 了水 生 号培 养 基 〔，中 的无 机 碳源碳 酸 氢 钠 ， 添 加 葡 萄糖作 为支持 小球 藻 生 长 的惟 一 有机 碳 源 培 养 基 初 始 都调 至 左 右 ， 按 每 溶液 中加 入 琼 脂粉 的 比例 加 入 琼脂 后 ， 可 制 备 出对 应 的 固体培 养基 实验 条件 光 照 静 置 培 养 主 要 用 于 异 养 小 球 藻 种 的筛 选 ， 所 用 实验 器 皿 为 玻 璃 三 角 瓶 ， 培 养 量 培 养温 度 ℃ ， 光 照 黑 暗循 环 ， 光 照 强度 异 养 批 量 培 养 在 摇 床 内进 行 ， 无 光 照 ， 摇床 转速 为 · 一 ，， 温 度 ℃ ， 所 用 实验 器 皿和 培养 量 与 光 照 培养 条件 相 同 实验 用器 皿 和 配 制 的培 养基 均 经 ， ℃ 的高温 高压 和 刃 紫 外 灯 照 射 的灭 菌 后 使用 小球 藻 种 的筛 选 年 月 取 北 京清河 含绿藻 的河水 ， 先 用 滤 纸 过 滤 去 除 大 型 颗 粒 物 后 将 滤 液 放 入 离 心 管 内 ， 在 · 一 ，下 离心 倒 净 上 清 液 ， 加 入 经 高温 高压 灭 菌 的水 生 号 培 养 基 ， 经 振 荡 使 藻 细 胞悬 浮 ， 再 经 离 心 后 倒 去 上清 液 按 照 上 述清 洗藻 细 胞 步 骤 重 复 三 次 后 ， 取 藻 悬 浮 液 于培 养 基 中先 进 行光 照 培 养 ， 培 养 后 取 样 再 重新 接 种 于 新鲜 培 养 基 中进 行 光 照 培 养 ， 重 复光 照 培 养 三 次 后 ， 取 培 养物 接种 于含 有 ’ 一 ，葡 萄糖 的培 养基 中进 行光 照 培 养 ， 后 再 取 培 养 物 重 新 接 种 于 相 同 的 培养 基 中 ， 重 复培 养 次后 ， 将 培 养物用 含葡 萄 糖 的培 养 基 稀 释 不 同倍 数 后 涂 抹 于 固体 培 养基 上 ， 光 照 培 养 后 挑 取 深 绿色 单 克 隆藻 菌 落 接 种 于 液 体 培 养 基 中进 行 黑 暗 条 件 下 的异 养 批 量 培养 ， 以在 批 量 培养条件 下 藻 类 是 否 能够 生 长 来 识别 筛 选 藻 种 是 否 具 有 异 养 能 力 采 用 此 种 方 法 ， 成 功筛选 出一株 能够 在黑 暗条件 下 生长 于葡 萄糖 的 小 球 藻种 研 究方 法 在 葡 萄 糖 作 为藻类 生 长 惟 一碳源 的情 况 下 ， 分 别研 究 了 不 同含 氮 化 合 物 对 筛 选 小 球 藻 生 长 的效应 在研 究确 定 出能够 支 持 小球 藻 生 长氮源 的基础 上 ， 更 进 一 步研 究 了不 同碳 氮 比对 小球 藻 生 长 的效应 实验前 分 别 测定 了藻 液在 下 的吸 光 度 ‘。 动 和 藻 细 胞 的干 重 浓 度 ， 并在显 微镜 下用 血 球 计数 板 计数 换算 出 了藻 细 胞 浓 度 ， 建立 了 吕。 。 分 别 与 藻 细 胞 浓 度和 藻 细 胞 干 重 浓 度 的线 性关 系 实验 中直接测 定 。 二 以示 藻 类 的生 长 ， 当藻类 浓度 大 时 ， 需稀释 后 测 定 ， 使测 定值 在 一的线 性关系 ， 再 根据 稀 释倍 数计算 出藻 细 胞 浓 度 同 时测 定 藻类 培 养 物 的 ， 以确 定藻类批 量 培 养 的优 化 控 制 条件 结 果 与 讨 论 小 球 藻 的筛 选 和 识 别 图 是在 固体培养基 上长 出的筛选 小球 藻单 克 隆菌 落 ， 其特 点是藻 菌落 较 大 ， 颜 色 深 绿 图 是 在显 微 镜 下观 察 小球 藻细 胞 形 态 的显微 照 片 ， 图 中显 示 筛 选 小球 藻 细 胞 圆形 ， 单 独 存 在 ， 细 胞 中 间有 一个 明显 的载色 体 ， 因此初 步确 定筛选 的 藻种 为 小 球 藻 图 是 此 筛选 小球 藻 分 别在 光 照 自养 和 批 量 异养培养 条 件 下培 养 后 的照 片 ， 虽 然 此 小球 藻在 自养和 异养 条件下 都 能够 生长 ， 但异 养 批量 培养 出 的小 球藻颜色深 绿 ， 细 胞浓度 明显 高 于 光 照 自养 培 养 下 的 小球 藻 细 胞浓 度 图 筛选小球藻的 单克隆 藻菌落 啥 沙 记 坦 图 显 微镜下 筛 选小 球藻 的细胞 形 态 幼 ， 目前 国 内外 在 异 养 培 养 小 球 藻 方 面 进 行 了 大 量研 究 ， 一般 认 为在 异 养 培 养 过 程 中 ， 由于 小 球 藻 叶绿 素 含 量 降低 ， 使 细 胞 颜色 黄 化 ‘，， 而 笔 者 筛 选 的小 球 藻 即 使在 无 光 照 异 养 批 量 培 养 条 件 下 ， 其颜色 仍 然 保 持墨绿 图 ， 说 明此 小球 藻 在 有 无 光 照 条件 下 对 其 细 胞 色 素 合 成 的影 响 不
·410- 北京科技大学学报 2005年第4期 的生长基本处于停顿状态.当以尿素作为惟一氯 异养培养 自养培养 源时，从实验第二天开始小球藻的生长一直保持 最好，在实验结束的第四天OD6m已经达到了 49.5.当硝酸钾作为惟一氨源时，实验第一天后 小球藻的生长进入指数期，在实验第四天OD6m 也达到了46.3的较高水平.上述结果表明，尿素 是支持小球藻快速稳定生长的最好氨源，这与文 献[9]得到的结果一样. 50 图3筛选小球藻自养和异养培养的差异 Fig.3 Difference of isolated Chlorella sp grown in autotrophic and ◆氯化铵 40 一尿素 heterotrophic cultures 古硝酸钾 大，其机理有待进一步研究 2.2ODm分别与细胞浓度和细胞干重浓度的线 性关系 在ODm从0到0.45范围内，ODmm与藻细 10 胞浓度和细胞干重浓度之间都有非常好的线性 关系（图4），均达到0.99以上.通过对检测数据 2 的一元线性回归拟合，可以分别得到： 时间d 图5不同氨源对小球藻生长的效应 藻细胞浓度(10mL-)=19.6260D60m+0.0487,R2= Fig.5 Effeet of nitrogen source on the growth of Chlorella sp 0.9988: 藻细胞干重浓度(gL-)=0.357ODm-0.0027,R 从不同含氮化合物作为氮源培养小球藻过 =0.9947. 程中的pH变化情况看，当氯化铵作为惟一氮源 通过上述两个方程，可以用测定的OD=直 时，培养物中的pH随时间的延长迅速下降，从初 接计算出对应的藻细胞浓度和藻细胞干重浓度， 始时的6.85下降到实验第二天的4.12和第四天 此结果与文献[11]得到的结果基本一致. 的3.58（图6）.当硝酸钾作为氮源时，培养物的pH 2.3不同氨源对小球藻生长的效应 逐渐增加，从初始的7.04增加到实验结束时的 在葡萄糖初始浓度为20gL和总氮初始浓 8.85(图6).如果采用尿素作为惟一氮源，藻类培 度都分别为500mgL1下，图5显示实验第一天 养物中H的变化经历了先略降低后升高的过 以氯化铵作为氨源时藻生长较好，但此后小球藻 程，H从实验初始的722升高到第四天的7.90 (图6). 10 0.35 从图5和6可以看出，虽然氯化铵是支持小 8 0.28 球藻生长的较好氮源，但随着小球藻对铵的利用 目 ·细胞浓度 赵 导致培养物pH迅速降低，因此强烈抑制了小球 6 ▲干重浓度 0.21 藻的持续生长.与之相反，当采用硝酸钾作为惟 一氯源时，培养物的pH逐渐增加，但即使pH增 4 0.14 加到接近9.0时小球藻的生长也没有受到明显影 2 0.07 响，这说明筛选的小球藻能够耐受比较高的pH, 而对低pH比较敏感.虽然尿素是支持小球藻持 0 0.1 0.203 0.4 0.5 续生长的最好氮源，但与硝酸盐相比其被微生物 0 OD 的可利用性高，因此选择硝酸钾作为惟一氮源进 图4ODm与小球藻细胞浓度和细胞干重浓度的线性关系 行进一步研究。 Fig.4 Linear relationships of the density of cells and the dry 2.4不同碳氮质量比小球藻生长的效应 weight of Chlorella sp with OD 在硝酸氮初始质量浓度都为1.0gL时，分
一 北 京 科 技 大 学 学 报 年 第 期 的生长基 本 处 于停顿状态 当 以尿 素作 为惟 一氮 源 时 ， 从 实验 第 二 天 开始 小球 藻 的生长 一 直保 持 最 好 ， 在 实验 结束 的第 四天 。 二 已 经 达 到 了 当硝 酸 钾 作 为惟 一氮源 时 ， 实验 第 一 天 后 小球 藻 的生长进 入 指 数 期 ， 在 实验 第 四天 砌， 也 达 到 了 的较 高 水平 上 述 结 果表 明 ， 尿 素 是支持 小球藻 快速 稳 定生长 的最 好氮源 ， 这 与文 献 」得 到 的结 果 一样 尿氯硝 图 筛选小球藻 自养和 异 养培养的差 异 们兔附优 邝 均 一今 一 一山尸 成吕与 大 ， 其机 理 有 待进 一 步研 究 俐 分 别 与细 胞 浓度和细 胞 干重 浓度 的线 性关 系 在 石。。 二 从 到 范 围 内 ， ‘。 。 与藻 细 胞 浓 度 和 细 胞 干 重 浓度 之 间 都有 非 常好 的线 性 关系 图 ， 尸均达 到 以上 通过对 检 测 数据 的一 元 线 性 回 归拟 合 ， 可 以分 别 得到 藻 细胞浓 度 一 ， 。。。。 ， 尸 藻 细 胞干 重 浓 度’ 一 ’二 。一 ， 尸 通 过 上 述 两个 方 程 ， 可 以用 测 定 的 。 直 接 计 算 出对 应 的藻 细 胞浓 度和 藻细 胞干 重浓度 此 结 果与 文 献 〔得 到 的结果 基 本 一 致 不 同氮 源 对 小球 藻生 长 的效应 在葡 萄 糖 初 始 浓 度 为 · 一 ’和 总 氮初 始 浓 度 都 分 别 为 · 一 ，下 ， 图 显 示 实验第 一 天 以氯 化钱 作为氮源 时藻生 长较 好 ， 但此 后 小球 藻 二 ，一二 一 一 一 一上， 一 一 时 间 图 不 同 氮源 对 小球藻生 长 的效应 价 ，戊 勿如 甲 助 岁 侧 说 侧 韶 界 减 从 不 同含 氮 化 合 物 作 为 氮源 培 养 小 球 藻 过 程 中 的 变化 情况 看 ， 当氯化 按 作 为惟 一氮源 时 ， 培养 物 中 的 随 时 间 的延 长 迅速 下 降 ， 从 初 始 时 的 下 降到 实验第 二 天 的 和 第 四天 的 图 当硝 酸钾 作为氮 源 时 ， 培养 物 的 逐 渐 增 加 ， 从 初 始 的 增 加 到 实验 结 束 时 的 图 如 果采 用 尿 素 作 为惟 一 氮 源 ， 藻类 培 养 物 中 的变 化 经 历 了先 略 降低 后 升 高 的过 程 ， 从 实验初 始 的 升 高到 第 四天 的 图 从 图 和 可 以看 出 ， 虽 然 氯 化钱 是支 持 小 球藻 生长 的较好氮 源 ， 但 随着 小球 藻对钱 的利用 导 致 培 养物 迅速 降低 ， 因此 强 烈抑 制 了小球 藻 的持 续 生长 与 之 相 反 ， 当采 用 硝 酸钾 作 为惟 一 氮源 时 ， 培 养 物 的 逐 渐 增 加 ， 但 即 使 增 加 到接近 时小球 藻 的生 长 也 没有 受 到 明显 影 响 ， 这 说 明筛选 的小 球 藻 能够 耐受 比较 高 的 ， 而对 低 比较 敏 感 虽 然尿 素 是 支持 小球 藻持 续 生 长 的最好 氮 源 ， 但 与硝 酸 盐 相 比其被 微 生物 的可 利用 性 高 ， 因此选择硝 酸 钾 作 为惟 一氮源 进 行 进 一 步研 究 不 同碳氮 质 量 比小球 藻 生 长 的效 应 在硝 酸氮初 始 质 量 浓 度 都 为 ’ 一 ‘ 时 ， 分 ▲ ︵ 一乙侧嫌界澎日一︾留口 ︺ 书 匕‘几一一一一一一 即 二 图 二 与小 球藻细胞浓度和 细 胞干 重浓 度 的线 性关 系 叭 邝，卜 口 盛胡
Vol.27 No.4 闫海等：小球藻的筛选和异养培养 411· 80 13.8gL4 60 ◆27.5gL 10 ◆41.3g-L 61.9gL1 ◆一氯化铵 40 ■尿素 ☆一硝酸钾 ◆一酵母粉 据 20 0 2 3 2 时间d 时间d 图7不同碳氮比对小球藻生长的效应 图6不同氨源下小球藻培养物中pH变化 Fig.7 Effects of different carbon-nitrogen ratios on the growth of Fig.6 Changes in pH of Chlorella sp culture solution using differ- Chlorella sp ent nitrogen sources 养培养条件下，大约有50%的葡萄糖会转化为二 别添加了不同初始质量浓度的葡萄糖，使碳氮质 氧化碳，也就是说只有50%左右的葡萄糖能够被 量比分别为5：1,101,15：1和20：1.图7表明，葡萄 藻类利用，因此在异养培养小球藻过程中的碳氨 糖初始质量浓度高者在实验开始第一天时，小球 质量比应该在10以上，这与本文得到的结果（图 藻的生长少，说明尽管葡萄糖可以作为支持筛选 )基本一致.在批量培养没有进行流加和没有 小球藻异养生长的有机碳源，但较高的葡萄糖初 H控制条件下，一般小球藻细胞干重浓度都在 始质量浓度会抑制小球藻的生长.当葡萄糖初始 10gL以下，而筛选出的小球藻在同样条件 质量浓度分别为13.8和27.5gL时，实验第二天 下细胞干重浓度却可以高达26gL'(ODm= 和第三天以后小球藻基本停止生长，其原因可能 73.8),说明筛选的小球藻有很强的异养生长能 是此时葡萄糖已被消耗到不足以支持小球藻继 力，具有非常重要的应用与开发前景， 续生长的地步.在葡萄糖初始质量浓度为61.9g ·L‘时，实验第三天以后小球藻的生长一直保持 3结论 最大，在实验结束的第五天ODm已高达73.8. 图7还显示，最终小球藻的生长在初始碳氨质量 (1)2004年5月从北京清河水中筛选出了一 比从5到20范围内随碳氮比的升高而增加，说明 株能够异养高速生长的藻类，藻细胞圆形，经初 碳源是决定小球藻最终生长量高低的主要因素， 步鉴定为小球藻. 同时也说明小球藻在缺氨情况下仍然可以保持 (2)在无光照异养批量培养条件下，尿素和硝 高速的生长， 酸钾是支持此筛选小球藻持续生长的较好氮源. Si等报道当葡萄糖初始质量浓度高于80 氯化铵虽然是藻类可利用的较好氮源，但其被利 gL1时会对小球藻的生长产生抑制，本研究表 用时会导致pH的迅速降低，因此明显抑制了小 明当葡萄糖初始质量浓度大于本实验中最低质 球藻的进一步持续生长. 量浓度13.8gL时就会影响小球藻的生长，因 (3)当葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长 此在全自动发酵罐发酵培养小球藻过程中，依据 的碳源和氮源时，在碳氮质量比从5到20范围 小球藻的生长状况对葡萄糖进行流加补给，是避 内，小球藻的生长随碳氮质量比的升高而明显增 免过高葡萄糖浓度抑制小球藻生长的较好方法. 加，最高ODm达73.8，对应藻细胞干重浓度达 张丽君等认为在葡萄糖和硝酸钾分别作为小 26gL. 球藻生长的碳源和氨源时，碳氮质量比维持在4 到5之间是一种比较优化的控制条件，而本实验 参考文献 结果表明碳氮质量比保持在10以上更好（图7）. []中国农业科学院资料室编译.国外小球藻的实验和研究 上海：上海科学技术出版社，1961.256 一般来说碳占藻干重的49%~70%，而氮占藻干 2]陈峰，姜悦。微藻生物技术.北京：中国轻工业出版社， 重的1%~11%，碳氨质量比在5以上.因为在异 1999.55
一 闻海 等 小 球 藻 的筛 选 和 异 养 培 养 氯化按 尿素 硝酸钾 酵母粉 ， ’ 一 ’ 『尸 几 一 ’ · 一 犷一一一 一 ’ ‘ ‘ 广七 声歼犷一 尸 尸一 ，，一月 ︹ 拟澎率州、自吕， 匕 时 间 图 不 同 氮源 下 小 球藻培 养 物 中 变 化 左恤 代 月巴 时 间 图 不 同 碳氮 比对 小 球藻 生 长 的效应 月兔代 一 〔滋勿理刁恤 别添 加 了不 同初 始质 量浓 度 的葡萄糖 ， 使碳氮 质 量 比 分 别 为 ， ， 和 图 表 明 ， 葡 萄 糖初 始质 量浓 度 高者 在 实验 开 始 第 一 天 时 ， 小球 藻 的生长 少 ， 说 明尽 管葡 萄糖 可 以作 为支 持 筛选 小球 藻异养 生 长 的有机 碳源 ， 但 较 高 的葡 萄 糖初 始 质 量浓 度 会 抑 制 小球 藻 的生 长 当葡 萄糖 初 始 质 量浓度 分 别 为 和 · 一 ’时 ， 实验 第 二 天 和 第 三 天 以后 小球 藻 基 本停 止 生 长 ， 其 原 因可 能 是 此 时葡 萄 糖 己 被 消 耗 到 不 足 以支 持 小 球 藻 继 续 生 长 的地 步 在 葡 萄 糖 初 始 质 量 浓 度 为 · 一 ， 时 ， 实验 第 三 天 以后 小球 藻 的生 长 一 直 保 持 最 大 ， 在 实验 结束 的第 五 天 。 己 高 达 图 还 显 示 ， 最 终 小球 藻 的生 长 在 初 始 碳 氮 质 量 比从 到 范 围 内随碳 氮 比 的升 高而 增 加 ， 说 明 碳 源 是 决 定 小球 藻最 终 生长 量 高低 的主 要 因素 ， 同 时 也 说 明 小球 藻 在 缺 氮 情 况 下 仍 然 可 以保 持 高速 的 生 长 等 ‘ 报 道 当葡 萄 糖初 始 质 量 浓度 高 于 · 一 ， 时会 对 小球 藻 的生 长 产 生 抑 制 ， 本研 究表 明 当葡 萄 糖 初 始 质 量 浓 度 大 于 本 实验 中最 低 质 量 浓 度 · 一 ， 时 就 会 影 响 小球 藻 的生 长 ， 因 此 在全 自动 发 酵 罐 发 酵培 养 小球 藻过 程 中 ， 依据 小球 藻 的生长 状 况对 葡 萄糖进 行 流 加 补 给 ， 是避 免过 高葡 萄糖 浓度 抑 制 小球 藻 生 长 的较 好 方 法 张丽 君 等 『 认 为在 葡 萄糖 和 硝 酸钾 分 别 作 为 小 球 藻 生 长 的碳 源 和 氮源 时 ， 碳 氮质 量 比维 持 在 到 之 间是 一 种 比 较 优 化 的控 制 条 件 ， 而 本 实验 结 果 表 明碳 氮 质 量 比 保 持 在 以上 更 好 图 一 般 来 说 碳 占藻 干 重 的 一 ， 而 氮 占藻 干 重 的 一 ‘， 碳 氮 质 量 比在 以上 因 为在 异 养 培 养 条 件 下 ， 大 约 有 的葡 萄糖 会 转 化 为二 氧 化碳 ， 也 就 是 说 只 有 左 右 的葡 萄 糖 能够 被 藻类 利 用 ， 因此 在 异养培 养 小球 藻过 程 中的碳 氮 质 量 比应 该在 以上 ， 这 与本 文 得 到 的结 果 图 基 本 一 致 在 批 量 培 养 没 有 进 行 流 加 和 没 有 控 制 条 件 下 ， 一 般 小球 藻 细 胞 干 重 浓 度 都在 · 一 ， 以下 〔 ， 而 筛 选 出的小球 藻 在 同样 条 件 下 细 胞 干 重 浓 度 却 可 以 高 达 · 一 。 ， 说 明筛 选 的小 球 藻 有 很 强 的异 养 生 长 能 力 ， 具 有 非 常 重 要 的应 用 与 开 发 前 景 结 论 年 月 从 北 京清 河 水 中筛选 出 了 一 株 能够 异 养 高速 生 长 的藻类 ， 藻 细 胞 圆形 ， 经 初 步鉴 定 为 小球 藻 在 无 光 照 异养批量 培养 条件 下 ， 尿 素 和 硝 酸 钾 是 支 持 此筛选 小球 藻 持 续 生 长 的较 好 氮源 氯 化钱 虽 然 是藻类 可利 用 的较 好氮 源 ， 但 其被 利 用 时会 导致 的迅速 降低 ， 因此 明显 抑 制 了小 球 藻 的进 一 步 持 续 生 长 当 葡 萄 糖 和 硝 酸 钾 分 别 作 为 小球 藻 生 长 的碳 源 和 氮 源 时 ， 在碳 氮 质 量 比从 到 范 围 内 ， 小球 藻 的 生 长 随碳 氮质 量 比 的升 高而 明显 增 加 ， 最 高 。 。 达 ， 对 应 藻 细 胞 干 重 浓度 达 ’ 一 ， 参 考 文 献 【 中 国农 业 科 学 院 资 料室 编 译 国外 小球 藻 的 实验 和 研 究 上 海 上 海 科 学 技 术 出版 社 ， 陈 峰 ， 姜悦 微 藻生 物 技术 北 京 中国轻工 业 出版 社 ，
·412 北京科技大学学报 2005年第4期 [3]Yan H,YeC,Yin C.Kinetics of phthalate esters biodegradation [9]Shi X M,Zhang X W,Chen F.Heterotrophic production of bio- by Chlorella pyrenoidosa.Environ Toxicol Chem,1995,14(6): mass and lutein by Chlorella protothecoides on various nitrogen 931 sources.Enzyme Microb Technol,2000,27(3-5):312 [4]Yan H,Pan G.Toxicity and bioaccumulation of copper in three [10】张海滨，孙世春，麦康森，等傲藻异养培养技术的研究进 green microalgal species.Chemosphere,2002,49:471 展.海洋湖沼通报，2000，(351 [5】华汝成，单细胞藻类的培养与利用.北京：农业出版社出 [1]刘学铭，余若黔，粱世中.分批异养培养小球藻光密度值 版，.1986.120 与干重的关系.植物学通报，1999,26(5)：339 [6]Thinh L V,Griffiths DJ.Amino-acid composition of autotrophic [1]张大兵，吴庆余.小球藻细胞的异养转化，植物生理学通 and heterotrophic cultures of emerson strain of Chlorella.Plant 讯，1996,32(2)：140 Cell Physiol,1976,17(1):193 [13]Shi X M,Liu H J,Zhang X W,et al.Production of biomass and [7]Endo H,Hosoya H,Koibuchi T.Growth yields of Chlorella regu- lutein by Chlorella protothecoides at various glucose concentra- laris in dark-heterotrophic continuous cultures using acetate tions in heterotrophic cultures.Process Biochemistry,1999,34 Fermentation Technol,1977,55(4):369 (4:341 [8]Ogbonna JC,Masui H,Tanaka H.Sequential heterotrophic/auto- [14)]张丽君，杨汝德，肖恒.小球藻的异养生长和培养条件优 trophic cultivation-An efficient method of producing Chlorel- 化.广西植物，2001,21(4)：353 la biomass for health food and animal feed.J Appl Phycol [15]余若黔，刘学铭，梁世中，等.小球藻的异养生长特性研究 1997,94:359 海洋通报，2000,193：57 Isolation and heterotrophic culture of Chlorella sp YAN Hai,ZHOU Jie",HE Hongsheng,WEI Yuxia,SUN Jianxcin 1)Applied Science School,University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083,China 2)Guangdong Lvbaiduo Biotechnology Company,Zhanjiang 524017,China ABSTRACT A strain of microalga that has a strong ability in the utilization of organic compounds was isolated from Qinghe River in Beijing and identified as Chlorella sp.The effects of nitrogen compounds and carbon-to-ni- trogen mass ratio on the growth of this isolated Chlorella sp were investigated in batch cultures.Using glucose as the sole carbon source,both potassium nitrate and urea could be used as the sole nitrogen sources to support the con- tinuous growth of Chlorella sp,respectively.When ammonium chloride was used as the sole nitrogen source,the growth of Chlorella sp could be apparently inhibited by the rapid decrease in pH of culture solution.When glucose and potassium nitrate were used as the sole carbon and nitrogen sources,respectively,the growth of Chlorella sp in- creased with the increase of carbon-to-nitrogen mass ratio in range from 5 to 20,and the maximum OD of 73.8 was obtained. KEY WORDS Chlorella sp;isolation;heterotrophic culture;carbon source;nitrogen source
北 京 科 技 大 学 学 报 年 第 期 、乞 ， ， 」 】 仍兜加止如 血 ， ， 』泣， 葫 代 ， ， 华汝 成 ， 单 细胞 藻类 的培养与利用 北 京 农 业 出版社 出 版 ， 〔 ， 记 明 呱 ， ， ， 叮 践 工 】 爬 庄， 恤 卜 山℃ 七 ， ， 【 ， ， 毛知 砍 廿叩 一 尸 ， 件界 ， ， ， ， 小 ’。 尸阳而法绍 甜 及七 ， ， 一 〔 张海滨 ， 孙 世春 ， 麦康森 ， 等 ， 微 藻异养培 养技术 的研 究进 展 海洋 湖沼 通报 ， ， 【 」刘 学铭 ， 余若黔 ， 梁 世 中 分批 异养培 养小球 藻光 密度值 与 干 重 的关 系 植物学通报 ， ， 「张 大兵 ， 吴庆 余 小球藻 细胞 的异养转 化 植物生 理学通 讯 ， ， ， ， ， 勿 咫 ， 加 甲 加邝 ， 七如盆乃、 ， 【 张 丽 君 ， 杨汝 德 ， 肖恒 小球藻 的异 养生 长 和 培养条件优 化 广西植物 ， ， 〔余若黔 ， 刘学铭 ， 梁世 中 ， 等 小球藻 的异养生长 特性研 究 海洋 通报 ， ， 恤 别刀 ， ，月咙物脚笋推 毛职曰 圣泳’礼， ， ， ， 召 罗 ， ， 耐 形 一 一 甘 ， 丁 仆 ， ， 歹。州 奴叮 】 曲 ， ， 侧 一而 ， 助 。切 。 。 印 止
