酶联免疫技术 孙正辉16307100005 概论: 1971年瑞典学者 Engvail和 Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和 Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法 ( Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)。它的中心就是让抗体与酶复合物结合 然后通过显色来检测 技术原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶(辣根过氧化物酶(⊕P)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等, 其中以HRP应用最广)连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又 保留酶的活性。 ③在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应 ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相 载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例 ⑤加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量 直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。 主要方法原理: (1)双抗体夹心法:双抗体夹心法是检测抗原最 常用的方法,操作步骤如下 ①将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体: 洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2∴ 物是色 ②加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时 间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成 双抗体夹心法测定执原 固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质 ③加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 ④加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗 原的定性或定量分析。 根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 (2)间接法:间接法是检测抗体最常用的方法, 其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受 检抗体,故称为间接法。操作步骤如下: ①将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:测抗体 酶标执体 洗涤除去未结合的抗原及杂质 ②加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结 间接法测定抗体 合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体 上只留下特异性抗体。其他抗体及血淸中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被 洗去。酶联免疫技术 孙正辉 16307100005 概论： 1971 年瑞典学者 Engvail 和 Perlmann,荷兰学者 Van Weerman 和 Schuurs 分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它的中心就是让抗体与酶复合物结合， 然后通过显色来检测。 技术原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶（辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等， 其中以 HRP 应用最广）连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又 保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。 ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相 载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。 主要方法原理： （1）双抗体夹心法：双抗体夹心法是检测抗原最 常用的方法，操作步骤如下： ①将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体： 洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时 间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成 固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 ③加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 ④加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗 原的定性或定量分析。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 （2）间接法：间接法是检测抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受 检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： ①将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原： 洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ②加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结 合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体 上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被 洗去