酶联免疫技术 孙正辉16307100005 概论: 1971年瑞典学者 Engvail和 Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和 Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法 ( Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)。它的中心就是让抗体与酶复合物结合 然后通过显色来检测 技术原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶(辣根过氧化物酶(⊕P)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等, 其中以HRP应用最广)连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又 保留酶的活性。 ③在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应 ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相 载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例 ⑤加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量 直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。 主要方法原理: (1)双抗体夹心法:双抗体夹心法是检测抗原最 常用的方法,操作步骤如下 ①将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体: 洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2∴ 物是色 ②加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时 间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成 双抗体夹心法测定执原 固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质 ③加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 ④加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗 原的定性或定量分析。 根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 (2)间接法:间接法是检测抗体最常用的方法, 其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受 检抗体,故称为间接法。操作步骤如下: ①将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:测抗体 酶标执体 洗涤除去未结合的抗原及杂质 ②加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结 间接法测定抗体 合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体 上只留下特异性抗体。其他抗体及血淸中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被 洗去
酶联免疫技术 孙正辉 16307100005 概论： 1971 年瑞典学者 Engvail 和 Perlmann,荷兰学者 Van Weerman 和 Schuurs 分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它的中心就是让抗体与酶复合物结合， 然后通过显色来检测。 技术原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶（辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等， 其中以 HRP 应用最广）连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又 保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。 ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相 载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。 主要方法原理： （1）双抗体夹心法：双抗体夹心法是检测抗原最 常用的方法，操作步骤如下： ①将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体： 洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时 间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成 固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 ③加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 ④加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗 原的定性或定量分析。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 （2）间接法：间接法是检测抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受 检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： ①将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原： 洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ②加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结 合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体 上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被 洗去
③加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。(例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗 人IgG抗体。) ④加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被 抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 技术应用 (1)检测食物中有毒有害物质: ①毒素:主要指能引发人中毒的霉菌代谢产物,最迄今发现的毒性和致癌 性最强的天然污染物 常见且研究最多的是黄曲霉毒素和赫曲霉毒素。如用是黄曲霉和寄生曲 ELISA检测牛奶中黄曲霉毒素AFTM的残留量,当其浓莖代种物生的次 度大于30ppt时, ELISA比高效液相色谱准确度和精确 度都要高。用 ELISA检测酱油中黄曲霉毒素AFTB1的残 留量,可大大提高阳性检出率,使超过5μg/kg的样品 检出更准确。用 ELISA检测食物中罂粟壳添加量,可以 使最低检出限为0.1ng/ml ②药物残留:主要指微量药物原体,有毒代谢物,降解物以及杂质等。用 ELISA可检测 海水样品及海洋贝类中有机氯农药DT及其主要代谢物的含量或溴氰菊酯残留。近年来, ELISA更是被用于检测诸多食品安全问题的“罪魁祸首”,如用 ELISA检测尿样、脏器和饲 料中的盐酸克伦特罗(瘦肉精)含量,检测范围可达1.56μg/m1-1.90ng/ml,三聚氰胺直 接或间接竞争 ELISA检测方法线性范围分别为0.05-10ug/L和0.1-1000ug/L。 ③过敏原:用夹心 ELISA法检测鱼类过敏源, 检测限为每千克食物中含鱼小清蛋白0.01mg,相当 于每千克食物中5mg鱼肉 ④微生物:用 ELISA检测奶样中的沙门氏菌 与常规方法相比,直接 ELISA方法敏感性和特异性 分别为100%和99.7%,所需检测时间也更短(2-3d)。 (2)检测食物中生理活性物质: ①用 ELISA检测牛初乳中的乳铁蛋白含量,最 小检出量为0.5ng/ml。也可以用 ELISA检测常规方法无法检测出的被添加在保健食品中的 免疫球蛋白。 (3)转基因食品的检测: ①通过检测某些特定的转基因表达蛋白,来确定某种食品原料是否来自于转基因生物。 技术优缺点 (1)优点:①快速:②专一(特异性);③灵敏度高:④通过高效率催化放大反应效 果:⑤食品大部分大小分子都可以直接或间接成为抗原,因而酶联免疫技术具有广泛可行性 ⑥试剂使用寿命长:⑦通过颜色判断结果具有直观性 (2)缺点:①对固相载体、包被抗体(或抗原)、酶标抗体及其工作浓度、酶底物及 供氢体等实验条件的选择均有严格要求;②在一步法测定中,应注意钩状效应(hook effect),类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时,过量 抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复合物,所得结果将低于实际含量 钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果:③用粗提抗原包被可能发生假阳性反应;④该法测
③加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后， 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。（例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗 人 IgG 抗体。） ④加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被 抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 技术应用： （1）检测食物中有毒有害物质： ①毒素：主要指能引发人中毒的霉菌代谢产物，最 常见且研究最多的是黄曲霉毒素和赫曲霉毒素。如用 ELISA 检测牛奶中黄曲霉毒素 AFTM1 的残留量，当其浓 度大于 30ppt 时，ELISA 比高效液相色谱准确度和精确 度都要高。用 ELISA 检测酱油中黄曲霉毒素 AFTB1 的残 留量，可大大提高阳性检出率，使超过 5μg/kg 的样品 检出更准确。用 ELISA 检测食物中罂粟壳添加量，可以 使最低检出限为 0.1ng/ml。 ②药物残留：主要指微量药物原体，有毒代谢物，降解物以及杂质等。用 ELISA 可检测 海水样品及海洋贝类中有机氯农药 DDT 及其主要代谢物的含量或溴氰菊酯残留。近年来， ELISA 更是被用于检测诸多食品安全问题的“罪魁祸首”，如用 ELISA 检测尿样、脏器和饲 料中的盐酸克伦特罗（瘦肉精）含量，检测范围可达 1.56μg/ml-1.90ng/ml，三聚氰胺直 接或间接竞争 ELISA 检测方法线性范围分别为 0.05-10μg/L 和 0.1-1000μg/L。 ③过敏原：用夹心 ELISA 法检测鱼类过敏源， 检测限为每千克食物中含鱼小清蛋白 0.01mg，相当 于每千克食物中 5mg 鱼肉。 ④微生物：用 ELISA 检测奶样中的沙门氏菌， 与常规方法相比，直接 ELISA 方法敏感性和特异性 分别为 100%和 99.7%，所需检测时间也更短（2-3d）。 （2）检测食物中生理活性物质： ①用 ELISA 检测牛初乳中的乳铁蛋白含量，最 小检出量为 0.5ng/ml。也可以用 ELISA 检测常规方法无法检测出的被添加在保健食品中的 免疫球蛋白。 （3）转基因食品的检测： ①通过检测某些特定的转基因表达蛋白，来确定某种食品原料是否来自于转基因生物。 技术优缺点： （1）优点：①快速；②专一（特异性）；③灵敏度高；④通过高效率催化放大反应效 果；⑤食品大部分大小分子都可以直接或间接成为抗原，因而酶联免疫技术具有广泛可行性； ⑥试剂使用寿命长；⑦通过颜色判断结果具有直观性。 （2）缺点：①对固相载体、包被抗体（或抗原）、酶标抗体及其工作浓度、酶底物及 供氢体等实验条件的选择均有严格要求；②在一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量 抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。 钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果；③用粗提抗原包被可能发生假阳性反应；④该法测
定的是待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性;⑤该法不能对蛋白多肽做出阳性鉴定,如确 切的生化组成和序列
定的是待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性；⑤该法不能对蛋白多肽做出阳性鉴定，如确 切的生化组成和序列