基因探针法在食品检验中的应用 吴豪奇15302010016 概要: DNA基因探针技术是近年来发展起来的一种高新生物技术,并以 其敏感性、特异性、简便、快速的优点,在食品科学领域得到了广泛 的应用。这篇文章着重介绍了这一种技术的基本原理及其在食品检测 中的应用概况,并对其在食品检测领域里应用存在的问题进行了分析 和阐述。 技术原理: 基因探针技术即DNA探针技术,又称分子杂交技术,是利用DNA 分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性,对某一特异性 DNA序列进行探查的新技术。 两条不同来源的核酸 链如果具有互补的碱基序 多 列,就能够特异性的结合“ single t reponer eny 而形成分子杂交链。若在 已知的DNA或RNA片段上 (yLyseand Lml.AAAA. 加上可识别的标记(如用 32P同位素标记、生物素m=2Nm anst ain, a the cps tail that h urad reps ter nr laptr e pgone cs used 标记),就可制成DNA探针, 用以检测未知样品中是否有与其互补的基因序列,并可进一步判定其
基因探针法在食品检验中的应用 吴豪奇 15302010016 概要： DNA 基因探针技术是近年来发展起来的一种高新生物技术,并以 其敏感性、特异性、简便、快速的优点,在食品科学领域得到了广泛 的应用。这篇文章着重介绍了这一种技术的基本原理及其在食品检测 中的应用概况,并对其在食品检测领域里应用存在的问题进行了分析 和阐述。 技术原理： 基因探针技术即 DNA 探针技术，又称分子杂交技术，是利用 DNA 分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性 DNA 序列进行探查的新技术。 两条不同来源的核酸 链如果具有互补的碱基序 列,就能够特异性的结合 而形成分子杂交链。若在 已知的 DNA 或 RNA 片段上 加上可识别的标记(如用 32 P 同位素标记、生物素 标记),就可制成 DNA 探针, 用以检测未知样品中是否有与其互补的基因序列,并可进一步判定其
与已知序列的同源程度。1 DNA探针使用方法分为3类 组织或细胞 抽提DNA 1.第一类称为短针法。如果DNA靶顺序链己知, 纯化好的2A 就可以用自动化学分析法将要判定的DNA多核苷 及探针 酸互补、标识。 等位基因1 等位基因2 2.第二类是应用于总的胞内DNA探针法。这种 PQ扩增、产生信号 方法要先提取然后用生物化学方法标识。它一船号 与等位基因匹配与等位基因2匹配 不能用于区别相似的、关系密切的生物。因为它 检测信号 们具有许多相似的DNA顺序(例如牛与羊)。上述 纯合等位基 两种方法都比较简单,费用也相对比较便宜。 合等位基因1 3.第三类方法是采用DNA 菌质粒 基因被限制酶 从两端剪开 同样的限制酶 用来打开质粒 重组的克隆技术。采用这种 技术能得到具有高度专一性 DNA片段分离的有 开的质粒两端互补 的探针,而不需有关靶顺序基四 的预先知识,但比较复杂,其 同时带有抗抗菌素基 基本过程是首先将DNA从 可以使用了。 DNA片段与质粒吻合 重组后的目标物中提取出来, 连接也是细菌酶。连接 酶是真正的分子酸水,它 然后进行克隆。当它们大量 能重建化学关系,加固遗 繁殖后即被收集起来标识, 再筛选出目标DNA,以决定杂交关系。这种使用探针的方法是所选择 的最适合的方法,采用克隆杂交法进行微生物分析的步骤为 1卿柳庭等核酸探针和PCR技术在食品检验中的应用动物医学进展200021(2
与已知序列的同源程度。1 DNA 探针使用方法分为 3 类： 1.第一类称为短针法。如果DNA 靶顺序链己知, 就可以用自动化学分析法将要判定的 DNA 多核苷 酸互补、标识。 2.第二类是应用于总的胞内 DNA 探针法。这种 方法要先提取然后用生物化学方法标识。它一般 不能用于区别相似的、关系密切的生物。因为它 们具有许多相似的 DNA 顺序(例如牛与羊)。上述 两种方法都比较简单,费用也相对比较便宜。 3.第三类方法是采用 DNA 重组的克隆技术。采用这种 技术能得到具有高度专一性 的探针,而不需有关靶顺序 的预先知识,但比较复杂,其 基本过程是首先将 DNA 从酶 重组后的目标物中提取出来, 然后进行克隆。当它们大量 繁殖后即被收集起来标识, 再筛选出目标 DNA,以决定杂交关系。这种使用探针的方法是所选择 的最适合的方法,采用克隆杂交法进行微生物分析的步骤为: 1 卿柳庭等.核酸探针和 PCR 技术在食品检验中的应用[J].动物医学进展,2000,21(2)
1)让细菌在有琼脂的培养基上形成克隆体 2)无菌膜复制在皿上,从克隆体中获取细胞,形成替代皿; 3)设法将膜上的细胞DNA双螺旋链打开,释放出单一DNA链,然后 DNA链被固定 4)与DNA探针互相配对具有靶顺序的微生物马上可被鉴别、计数 技术应用: 近年来DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活 跃。例如,在食品微生物检测中,大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特性, 利用大肠杄菌中编码该酶的基因序列作为目标DNA,并制成DNA探针, 用以检测食品中的总大肠杆菌 DNA探针用于食品中微生物检测的关键是DNA探针的构建。为保 证检测结果的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构建不同的DNA 探针。构建用于检测食品中微生物的DNA探针的原则是,以待检微生 物中特异性保守基因序列为目标DNA,以该序列的互补DNA作为杂交 探针,对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特征 的基因序列构建特异性的DNA探针 国外 Moseley等利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA片段作为基 因探针,检测临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌,敏感性为80 个细菌/克。Hill等人曾用[a-32門标记的DNA探针检测污染食品中 的产热敏性肠毒素(T)的大肠杆菌,其敏感性达100个细菌/克。国 内周志江等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的DNA片段
1)让细菌在有琼脂的培养基上形成克隆体; 2)无菌膜复制在皿上,从克隆体中获取细胞,形成替代皿; 3)设法将膜上的细胞 DNA 双螺旋链打开,释放出单一 DNA 链,然后 DNA 链被固定; 4)与 DNA 探针互相配对具有靶顺序的微生物马上可被鉴别、计数。 技术应用： 近年来 DNA 探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活 跃。例如，在食品微生物检测中，大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特性， 利用大肠杆菌中编码该酶的基因序列作为目标DNA，并制成DNA 探针， 用以检测食品中的总大肠杆菌。 DNA 探针用于食品中微生物检测的关键是 DNA 探针的构建。为保 证检测结果的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构建不同的DNA 探针。构建用于检测食品中微生物的 DNA 探针的原则是,以待检微生 物中特异性保守基因序列为目标 DNA,以该序列的互补 DNA 作为杂交 探针,对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特征 的基因序列构建特异性的 DNA 探针。 国外 Moseley 等利用生物素标记的克隆沙门氏菌 DNA 片段作为基 因探针,检测临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌,敏感性为 80 个细菌/克。Hill 等人曾用[a-32 P]标记的 DNA 探针检测污染食品中 的产热敏性肠毒素(LT)的大肠杆菌,其敏感 性达 100 个细菌/克。国 内周志江等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的 DNA 片段
作为探针,检测污染食品中产ST的大肠杆菌。陈倩等对自食品中以血 清学初筛分离出的78株 ESIEC菌株,以rp-z探针检测其HPI毒力岛 基因,结果检出了7株,可鉴定为 ESIEC大肠杆菌。 技术优缺点: 与传统微生物检测方法相比,基因探针技术既有其优点,又有不 可忽视的缺点 1.优点:①能克服传统食品微生物检验方法的不足,避免了传统 检测方式的种种弊端;②特异性强;③灵敏度高,提升了检测的精准 度;④操作简便、省时,简化了检测的操作流程,优化了检测结果。 2.缺点:①检测成本高;②速度相对较慢;③效率相对较低;④ 放射性同位素标记的DNA探针具有半衰期短,对人体有危害,作为常 规诊断、特别是在食品检测实验室中不太适用;⑤生物素标记的DNA 探针虽然对人畜无害,但生物素标记的DNA探针在紫外线照射下易分 解,同时食品中的内源性生物素化蛋白质和其他糖蛋白类物质常引起 背景加深和非特异性反应;⑥菌落杂交的敏感性也受其他因素的影 响 DNA探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术,但在实 际应用仍然存在一定的问题。但是随着生物技术的进一步发展和完 善,相信在不久的将来DMA探针技术在食品微生物检测中不失为一种 有效的检测技术
作为探针,检测污染食品中产 ST 的大肠杆菌。陈倩等对自食品中以血 清学初筛分离出的 78 株 ESIEC 菌株,以 rp-z 探针检测其 HPI 毒力岛 基因,结果检出了 7 株,可鉴定为 ESIEC 大肠杆菌。 技术优缺点： 与传统微生物检测方法相比，基因探针技术既有其优点，又有不 可忽视的缺点。 1.优点：①能克服传统食品微生物检验方法的不足，避免了传统 检测方式的种种弊端；②特异性强；③灵敏度高，提升了检测的精准 度；④操作简便、省时，简化了检测的操作流程，优化了检测结果。 2.缺点：①检测成本高；②速度相对较慢；③效率相对较低；④ 放射性同位素标记的 DNA 探针具有半衰期短,对人体有危害,作为常 规诊断、特别是在食品检测实验室中不太适用；⑤生物素标记的 DNA 探针虽然对人畜无害,但生物素标记的 DNA 探针在紫外线照射下易分 解,同时食品中的内源性生物素化蛋白质和其他糖蛋白类物质常引起 背景加深和非特异性反应；⑥菌落杂交的敏感性也受其他因素的影 响。 DNA 探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术,但在实 际应用仍然存在一定的问题。 但是随着生物技术的进一步发展和完 善,相信在不久的将来 DNA 探针技术在食品微生物检测中不失为一种 有效的检测技术