根据旋光色散研究的结果,这个酶的亚基大约有25-30%的a-螺旋,15%左右的β-折 叠 肌酸激酶是由两个亚基组成的寡聚酶,该酶在催化过程中,最小功能单位是亚基还是 二聚体,一直是有很大争议的问题。我系生化与分子生物学教研室的王希成教授等用化 学修饰和分子杂交的方法证明了肌酸激酶的两个亚基分别在二聚体中独立地起催化作 用,即最小功能单位是亚基 肌酸激酶的纯化方法有许多种,本实验采用的提纯方法为改进的Kuby法。该酶的 测活方法也有许多种,本实验采用的是pH-比色法 肌酸激酶的测活方法(pH-比色法)如下: 肌酸激酶在催化正向反应时,随着AP向肌酸上转移磷酰基的同时,生成等摩尔 的H,其最适pH为7~9.0,是一个宽阔的平台状,在此范围内测定H的生成速度, 可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂,在分光光度计上通过pH 比色法测定肌酸激酶的活性,在597nm波长下,监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化 反应生成的H使溶液的pH值降低,底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色,吸光 度值As不断降低。肌酸激酶测活的底物溶液通常可配制20ml,当天使用。配制方法 为:取10ml48 mmol/L的肌酸溶液,加入10ml0. Imol/L的MgAC2,2.0m01%的百里 酚蓝(称100mg百里酚蓝,加20ml乙醇溶解后再加水60mD,1.0ml0. ImoI/L pH90的 Gly-NaOH缓冲液,称48 mg AtP溶于此溶液,再补加水50ml,用0.1~02mo/ L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色(吸光度为1.8~2.0)即可。 测活时,取10ml的底物溶液置于微量比色皿中,加入10u酶溶液,迅速盖盖, 混匀后立即监测57nm处光吸收的变化,每15秒或30秒读一次吸光度值(As),共 读取5~6个数据点,用A597对时间作图,从图中求出每mn吸光度值的变化,即 △A597,按下式计算酶的比活力(U): ≈1.3×Nx稀释倍数[umol/( minong 其中:1.3为吸光度的变化换算成H的系数。VA=1.0ml(底物溶液),VB=00lml(加 入的酶溶液)。C为加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度C的测定按其在280nm处的吸光度 值来确定,其百分吸光系数为E1"1cm=8.8 A3s0×10 88×稀释倍数 258258 根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有 25-30％的α-螺旋，15 ％左右的β-折 叠。 肌酸激酶是由两个亚基组成的寡聚酶，该酶在催化过程中，最小功能单位是亚基还是 二聚体，一直是有很大争议的问题。我系生化与分子生物学教研室的王希成教授等用化 学修饰和分子杂交的方法证明了肌酸激酶的两个亚基分别在二聚体中独立地起催化作 用，即最小功能单位是亚基。 肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的 Kuby 法。该酶的 测活方法也有许多种，本实验采用的是 pH-比色法。 肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）如下： 肌酸激酶在催化正向反应时，随着 ATP 向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔 的 H+，其最适 pH 为 7.5～9.0，是一个宽阔的平台状，在此范围内测定 H+ 的生成速度， 可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为 pH 指示剂，在分光光度计上通过 pH- 比色法测定肌酸激酶的活性，在 597nm 波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化 反应生成的 H+使溶液的 pH 值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光 度值 A597 不断降低。肌酸激酶测活的底物溶液通常可配制 20ml，当天使用。配制方法 为：取 10ml 48mmol/L 的肌酸溶液，加入 1.0ml 0.1mol/L 的 MgAC2，2.0ml 0.1％的百里 酚蓝(称 100mg 百里酚蓝，加 20ml 乙醇溶解后再加水 60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液，称 48mg ATP 溶于此溶液，再补加水 5.0ml，用 0.1～0.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为 1.8～2.0）即可。 测活时，取 1.0ml 的底物溶液置于微量比色皿中，加入 10l 酶溶液，迅速盖盖， 混匀后立即监测 597nm 处光吸收的变化，每 15 秒或 30 秒读一次吸光度值(A597 )，共 读取 5～6 个数据点，用 A597 对时间作图，从图中求出每 min 吸光度值的变化，即 △A597，按下式计算酶的比活力（U）： ＝ 稀释倍数     B A C V A V U 3 597 1. [μmol／(min•mg)] 其中：1.3 为吸光度的变化换算成 H+的系数。VA =1.0ml (底物溶液)，VB =0.01ml (加 入的酶溶液)。C 为加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度 C 的测定按其在 280nm 处的吸光度 值来确定，其百分吸光系数为 E 1％ 1cm=8.8。 ＝ 稀释倍数  8.8 A280 10 C