、实验步骤 1.兔肌肌酸激酶的分高纯化方法如下: 将兔子颈动脉放血杀死后剥皮,取50g大腿肌或背肌,去除结缔组织和神经后剪碎, 加150 ml 0.01mol/L Kcl,用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各粉碎3次以上 每次不超过30s。冰浴搅拌提取15~30min,用8000/min,0℃,离心10min,弃 去沉淀,测上清体积为V1,取样0.5ml后,将其余上清加入研细的NH4Cl至浓度为 0.lmoL,用5mol/LNH4OH调pH至9.0,冰浴搅拌30min,加入1.5倍Ⅴ1体积的95 %冷乙醇,20℃搅拌2.5h,-8℃,8000r/min离心10min,弃沉淀,测上清体积为V2, 取样0.5m后加入VAml的2 mol/L MeSo(pH=85)至终浓度为003mol,并补加15VA 体积的95%冷乙醇,搅拌30min,-8℃,8000r/min离心10min,弃去上清,沉淀加 l/loⅥ体积的MgAC2(007mo/L,pH=90)溶解悬浮(可置冰箱过夜),冰浴搅拌h后, 0℃,12000r/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为V3,取样0.5m后用0.5~1mol/L NaOH调pl=80,置冰盐浴内缓慢加入VB体积的95%的冷乙醇至终浓度为36% VB的计算式为 ①一AC的加入量)x06+n=036 3+V 搅拌30min后,-8℃,12000/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为Ⅴ4, 取样0.5ml,置冰盐浴内缓慢加入Vc体积的95%的冷乙醇至终浓度为50% Vc的计算式为 V×036+c=05 搅拌30min后,-8℃,12000/min离心10min,弃上清,沉淀溶于2~3mlpH9.0 005mo几L的柠檬酸铵溶液,即为Vs,取样0.2ml,并对此缓冲液透析过夜,再对 1.7 mmol/L的NH4OH透析,0℃,12000r/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为 V6,取样0.5ml,其余的V6溶液用此NHOH透析液调蛋白的质量浓度为~5g/后上样 至DEAE-32离子交换层析柱,用001 mol/L PH80的 Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平, 用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶,收集活性峰,合并得到Vˉ样品,取样0.5m,其 余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。取样做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,测亚基 分子量,并检测其是否达到电泳一条带的纯度,再取样用凝胶层析测该酶的分子量259 二、实验步骤 1. 兔肌肌酸激酶的分离纯化方法如下： 将兔子颈动脉放血杀死后剥皮，取 50g 大腿肌或背肌，去除结缔组织和神经后剪碎， 加 150ml 0.01mol/L KCl，用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各粉碎 3 次以上， 每次不超过 30 s 。冰浴搅拌提取 15～30min，用 8000r/min ， 0℃， 离心 10min，弃 去沉淀，测上清体积为 V1，取样 0.5ml 后，将其余上清加入研细的 NH4Cl 至浓度为 0.1mol/L，用 5mol/L NH4OH 调 pH 至 9.0，冰浴搅拌 30min，加入 1.5 倍 V1 体积的 95 ％冷乙醇，20℃搅拌 2.5h，－8℃， 8000r/min 离心 10min，弃沉淀，测上清体积为 V2， 取样 0.5ml 后加入 VA ml 的 2 mol/L MgSO4(pH=8.5)至终浓度为 0.03mol/L，并补加 1.5 VA 体积的 95％冷乙醇，搅拌 30min ，－8℃，8000r/min 离心 10min，弃去上清，沉淀加 1/10 V1 体积的 MgAC2 (0.07mol/L，pH=9.0)溶解悬浮(可置冰箱过夜)，冰浴搅拌 1h 后， 0℃，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为 V3，取样 0.5ml 后用 0.5～1mol/L NaOH 调 pH=8.0，置冰盐浴内缓慢加入 VB 体积的 95％的冷乙醇至终浓度为 36％。 VB的计算式为： 0.36 ( ) 0.6 3 3 2 ＝ ＋ － 的加入量 ＋ B B V V V MgAC  V 搅拌 30min 后，－8℃，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为 V4， 取样 0.5ml，置冰盐浴内缓慢加入 VC 体积的 95％的冷乙醇至终浓度为 50％。 VC的计算式为： 0.5 0.36 4 4 ＝ ＋ ＋ C C V V V  V 搅拌 30min 后，－8℃，12000r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀溶于 2～3ml pH 9.0 0.05mol/L 的柠檬酸铵溶液，即为 V5，取样 0.2ml，并对此缓冲液透析过夜，再对 1.7mmol/L 的 NH4OH 透析，0℃， 12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为 V6，取样 0.5ml，其余的 V6 溶液用此 NH4OH 透析液调蛋白的质量浓度为～5g/L 后上样 至 DEAE-32 离子交换层析柱，用 0.01mol/L pH 8.0 的 Tris-HCl 平衡缓冲液洗至基线平， 用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶，收集活性峰，合并得到 V7 样品，取样 0.5ml，其 余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。取样做 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测亚基 分子量，并检测其是否达到电泳一条带的纯度，再取样用凝胶层析测该酶的分子量