316 病毒学杂志3,1989 Vir●l·i·sfic 进行 四、病骞滴价测定培养于24孔培养板( Coster)的细胞长成单层后,用无血清的Egle MEM将待测病毒悬液作10倍稀释,每孔接0.1m1,每一稀释度3个孔,培养2-3天,观察细胞 病变,按Reed和 Muech6法计算出 TCIDno/m1。同时呆用空斑滴定法(方法另文报道)计算病毒 悬液的PFU。 五,病毒赣殖曲线的测定细胞在直径为60mm的平皿( Corning)中培养2-3天,每平 皿加入0.1m1的病毒悬液(感染复数分别为0.05,1,20PFU/cel1)。接种方法同上,不同时 取样测定病毒滴价。 六.细传代病毒的回试验用细胞传代第16代GCHV-873回接3.5-4.2寸草鱼,每尾 注射03—05m1的病毒培养液,28°C-31°C水温条件下观察发病情况。 七.病毒部分提施及电赣收集感染了病毒的细胞培养液,8,000/m离心30分钟,去 细眴片,然后再经16,00x/m离心4小时,去上清,沉淀用1×9c(0.15mo1/L氯化钠,0.015m01/L 柠檬酸三钠,PH7.4)级冲液溶解。上述过程重复一次,沉淀用少量双蒸水悬浮滴于铜网上,晾干, 用2%磷钨酸(PH6.9)负染,置JEM-100C型电子显微镜观察。 结果与讨论 病毒的复制与传代 从病鱼组织中分离、制备的病毒悬液感染细胞,病变出现在48小时以后。病变伊 始,单层细胞局部出现边缘不整齐的空洞(图1),未感染的细胞无此现象〔图2)。随 着CPE的发展,整个单层细胞拉成网状,最后大部分饔解的细胞离壁飘浮于液面。从 感染到收集病毒这一过程约需5天时间。感染后第三天,用 ELISA法检测细胞培养 液呈阳性反应,未感染的细胞培养液则为阴性反应。随着传代次数的增加,病毒的毒力 和产量都有所提高,繁殖周期相应缩短,当病毒传至3—4代,这些指标逐步趋于稳定, 结果见表1。 病毒传代次数与滴价的关系 Table 1 Relationship between serial Propagation and titer of GCAV-873 病毒传代次数稀释度 收获时间(天) 病毒滴价( TCID50/m1) EL1sA检测 原代 十 7.2x10L 1 104 2 原代一一从病鱼组织制备的病毒悬液 二、通气条件对病毒增殖的影响 接种于24孔培养板的归毒,分别置28℃普通培养箱和CO2培养箱〔含5%C02) 培养,48小时后检查培养液的pH和病毒滴价,发现前者的pH为7,8-8.0,后者的pH316 蠹 篙 。 进 行。 四 、寰毒滴 债 定 培 养于 24孔培养板 (Coster)的细胞长成单层后 ，用无 血清的Eagle。s MEM 将 待 瓤病 毒 悬 蔽 作 l0倍 稀 释 ， 每 孔 接 0．1ml，每 一 稀 释 度 3个 孔 ，培 养 2— 3天 ， 观察 细 胞 病 变 ，按 Reed和 Mucch 法计 算 出 TCID5o／ml。同时 采 用 空 斑 清定 法 (方 法 另文 报 道 )计 算 病 毒 悬 液 的 PFU。 五 、寓毒 繁殖 曲壤 的霸 定 细胞在直 径为 60ram的 平皿 (Corn|ng)中培养 2—3天 ，每平 皿加 入 0．1ml的病 毒悬液 (感杂复数分 丑为 0．0s，l，20PFU／cel1)。 接种 方法同上 ．不 同时 同 取 样 测 定 病 毒 滴 价 。 六 ．细囊传 代寓●的 回接试验 用细胞传代第 16代GCH~-873回接 3．s一4．2寸 草鱼。每尾 注 射 0．3- 0．5ml的 病 毒培 养 液 ， 28。c一 3l。c水 温 条 件 下 观 察 发 病情 况 。 七 ．寓毒部分摄 纯殛皂鼍 曩寨 收集感染 了病毒 的细 胞培 养液 ，8，O00r／m离心 30分钟，去 细 强 碎 片 。 然 后 再 经 16．O00r／m离 心 4小 时 ，去 上 清 沉 淀 用 lx5Be(0．1Smo1／L氯 化钠 0．015mol／L 柠檬酸三钠 ，pH7．4)缓 冲液溶解 。上 述过程重复一次 ，沉淀用少 量双蒸水悬浮 滴于锕网上，晾干， 用 2嘶磷 钨 酸 (pH6．9)负 染 ， 置 JEM-IOOC型 电 子 显 微 镜 观 察 。 结 果 与 讨 论 一 ， 病 毒的复 制与传 代 从病 鱼 组织 中分离 ，制备 的病毒 悬液感 染细胞 ，病 变 出现 在 48小 时以后 。 病 变伊 始 ，单层 细胞局 部出现边 缘不 整齐 的空 洞 (图 1)，来 感染的 细胞无 此现 象 (图 2 )。随 着 CPE的发展 ，整 个单层 细胞 拉成网状 ， 最后大 部分裂 解 的细 胞离壁 飘 浮于 液 面。 从 感 染到收集病 毒这 一 过 程约 需 5天时 间。感 染后第 三天 ，用 ELISA法捡 测 细 胞 培 养 液呈 阳性 反应 ，来感 染的 细胞 培养 液则为 阴性反应 。随 着传 代次数 的增加 ，病 毒的 毒力 和产 量都 有所 提高，繁 殖周期 相应缩 短 ，当病 毒传 至 3— 4代，这 些指标逐 步趋 于稳定 ， 结果 见 表 1。 囊 1 卉 毒 传 代寝 敢与 囊 债的关 系 Tab1。 1 Reletloeship t tw咖 serla】prop4gatlon tⅡd titcr0f GCH V一873 ‘虏(代一一从病鱼组织箭备的病毒悬液 ¨ND一 一耒 测定 二 、 通 气 条 件 对 病 毒 增 殖 的 影 响 接 种于 24孔培 养板 的瘫 毒，分 别置 28℃ 普通 培养 箱和 CO 培 养箱 (含 5 CO ) 华养，48，卜时后检查培养液的pH和病毒滴价，发现前者的pHi7．8—8．0，后者的pH 维普资讯 http://www.cqvip.com