实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1 学习并初步堂据细菌的兰氏沈色法 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 、实验材料 1. 菌种：金黄色葡萄球茵(S1 apHylococcus aureus)大肠杆菌(E.coli) 2 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等 三、实验原理 革兰氏染色法是细茵学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后 用蕃红复垫。经讨此法染色后，细胞保留初垫剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌：如果细胞染 上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。 大肠杆菌是标准的革兰氏阴性，金黄色葡萄球菌足 标准的 兰氏阳性菌 革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所有的 细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细 菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽 聚糖层的网状结构 径缩 透 生降低， 人而使结品紫 碘的复合物不易被洗脱而保留在 胞内：革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时 类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上 红色。 加、操作步霾 将细菌 养琼脂斜面 培养约24h 3. 初染：于制片上滴加结品紫染液，染色1mn后，用水洗去剩余染料： 4. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约lmin,水洗。 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片顿斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载我 玻片上端冲洗脱色， 直到流 酒精无明显的紫色时 立即水洗。酒精的浓度、用量及 涂片厚度都会影 速度。脱 是革兰氏染色中最关键的一步。 6. 复染：滴加番红液，染色2min,水洗。 7.用法纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革兰氏垫色结果的正确性，制片村程中要注意：要洗用活跃生长的幼培养物 作革兰氏染色，涂片不宜过厚 火焰固定不宜过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1.分别对金黄色葡萄球茵和大肠杆菌进行革兰氏染色 2.对上述两种南进行混合涂片，再进行革兰氏染色。 实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1. 菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2. 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用 95%乙醇脱色、最后 用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染 上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是 标准的革兰氏阳性菌。 革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所有的 细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细 菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽 聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细 胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上 红色。 四、操作步骤 1. 细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约 24h。 2. 制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 3. 初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色 1min 后，用水洗去剩余染料。 4. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min，水洗。 5. 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用 95%乙醇从载 玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及 涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。 6. 复染：滴加番红液，染色 2min，水洗。 7. 用滤纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革兰氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物 作革兰氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不宜过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1. 分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色 2. 对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色