《生物技术制药》实验指导 3.取0.3ml菌液接种于20mlLB液体培养基的250ml三角瓶中37℃振荡培养2~ 3小时，待0D6oo值达到0.3~0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10~15分钟。 4.将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5.加入20ml用冰预冷的0.1mol/LCaC12溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中30分钟。 6.4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7.再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在4℃冰箱中放置12~24小时，即可应用于DNA转化。 (二)细菌的转化 1.取大肠杆菌DH-5新鲜感受态细胞1001于1.5 ml Eppendorf管中加入50~ 100ng质粒pUC118DNA,轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。 2.42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。 3.加入LB液体培养基9001,37℃保温60分钟。 4.取1001转化液涂布在含氨苄青霉素(（Amp)100gml的LB固体平板上， 37℃倒置培养16~24小时。 5.观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1.DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2.Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。《生物技术制药》实验指导 5 3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～ 3 小时，待 OD600 值达到 0.3～0.4 时，取下三角瓶，立即置冰浴 10～15 分钟。 4. 将细菌转移到一个灭菌的 50ml 离心管中，4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5. 加入 20ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中 30 分钟。 6. 4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7. 再加入 2ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在 4℃冰箱中放置 12～24 小时，即可应用于 DNA 转化。 （二）细菌的转化 1. 取大肠杆菌 DH- 新鲜感受态细胞 于 1.5ml Eppendorf 管中，加入 50～ 100ng 质粒 pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置 30 分钟。 2. 42℃热休克 120 秒，不要摇动 Eppendorf 管。 3. 加入 LB 液体培养基 ，37℃保温 60 分钟。 4. 取 转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp） 的 LB 固体平板上， 37℃倒置培养 16～24 小时。 5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1. DNA 与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2. Eppendorf 管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染