《生物技术制药》实验指导 (供生物技术专业使用) 杨德龙栗孟飞李唯编写 甘肃农业大学 生命科学技术学院生物制品系 2008年1月
《生物技术制药》实验指导 （供生物技术专业使用） 杨德龙 栗孟飞 李 唯 编写 甘肃农业大学 生命科学技术学院生物制品系 2008 年 1 月
学生实验守则 1.学生实验前必须认真预习，包括到实验室进行预习，并写好预习报告（含讲义指定 课前必做的内容及实验数据表格)。进入实验室须带上预习报告，经教师检查同意方可 进行实验。 2.严格按照实验分组表进行实验，不得擅自调整分组。遵守上课时间，不得无故迟到、 缺席。有事有病要事先向实验教师请假。一般情况下，所缺实验不得补做。 3.实验前检查、清理好所需的仪器、用具。如有缺损，应立即向教师报告，不得自己 任意拉用。 4.遵守课堂纪律，保持安静整洁的实验环境。严禁吃东西、随地吐痰、乱扔脏物、大 声喧哗等不文明行为。 5.使用电源时，严禁带电接线或拆线，务必经过教师检查线路后才能接通电源；实验 后要切断电源。 6.爱护仪器，严格按仪器说明书或操作规程操作。仪器用具发生故障、损坏或丢失等 特别情况，应立即向教师报告。严禁擅自拆卸、搬弄仪器。有损坏仪器，应做出书面检 查，等候处理。公用工具用完后应立即归还原处。 7.实验中要注意安全，如仪器设备出现异常气味、打火、冒烟、发热、响声、振动等 现象，应立即切断电源，关闭仪器，并向教师报告。 8.实验中若发生触电等人身伤害，应保持镇定并立即切断电源，马上向教师报告，以 便采取相应措施。 9.实验中要注意节约使用实验材料。 10.作完实验，学生应负责将仪器整理还原，桌面、凳子收拾整齐，经教师审查测量数 据和仪器还原情况并同意后，方可离开实验室。 11.实验室中任何仪器用具不得带出实验室。 12.每次实验后，由值日学生打扫卫生并协助教师收整仪器。 13.实验报告应在实验教师规定时间内交实验室。 2008年1月
学生实验守则 1．学生实验前必须认真预习，包括到实验室进行预习，并写好预习报告（含讲义指定 课前必做的内容及实验数据表格）。进入实验室须带上预习报告，经教师检查同意方可 进行实验。 2．严格按照实验分组表进行实验，不得擅自调整分组。遵守上课时间，不得无故迟到、 缺席。有事有病要事先向实验教师请假。一般情况下，所缺实验不得补做。 3．实验前检查、清理好所需的仪器、用具。如有缺损，应立即向教师报告，不得自己 任意拉用。 4．遵守课堂纪律，保持安静整洁的实验环境。严禁吃东西、随地吐痰、乱扔脏物、大 声喧哗等不文明行为。 5．使用电源时，严禁带电接线或拆线，务必经过教师检查线路后才能接通电源；实验 后要切断电源。 6．爱护仪器，严格按仪器说明书或操作规程操作。仪器用具发生故障、损坏或丢失等 特别情况，应立即向教师报告。严禁擅自拆卸、搬弄仪器。有损坏仪器，应做出书面检 查，等候处理。公用工具用完后应立即归还原处。 7．实验中要注意安全，如仪器设备出现异常气味、打火、冒烟、发热、响声、振动等 现象，应立即切断电源，关闭仪器，并向教师报告。 8．实验中若发生触电等人身伤害，应保持镇定并立即切断电源，马上向教师报告，以 便采取相应措施。 9．实验中要注意节约使用实验材料。 10．作完实验，学生应负责将仪器整理还原，桌面、凳子收拾整齐，经教师审查测量数 据和仪器还原情况并同意后，方可离开实验室。 11．实验室中任何仪器用具不得带出实验室。 12．每次实验后，由值日学生打扫卫生并协助教师收整仪器。 13．实验报告应在实验教师规定时间内交实验室。 2008 年 1 月
《生物技术制药》实验考核办法 考核内容包括实验预习、实验操作、实验设计、实验考试。要求学生每一步操作 都要规范、严谨，原始数据翔实可靠，数据敔处理实事求是，结果分析清晰可信。实验 结束后，进行讨论与总结，撰写实验报告，加深学生对原理的理解和掌握。准确、科 学地考核学生的知识、技术和能力，对综合素质提高起到导向作用。 学生本门实验课的最终成绩为平时成绩与实验设计成绩之和。考核采取多元评价 方式，考核内容主要有：平时成绩考核实验技能、实验态度、实验室常识等的掌握和 实验报告等方面；实验设计成绩考核学生的独立实验设计和实践过程，注重学生的创 新性思维及独立分析问题、解决问题能力等。 成绩 考核项目 分值 考核内容 考核方法 考察学生在实验过程中的 无故迟到一次扣3分 出勤情况、对实验课的重视无故旷课一次扣10 实验态度 10% 程度、预习情况、对实验室分。 仪器设备的爱护以及与其 他同学的合作情况等 考察学生实验操作技术的 教师根据对学生操作 实验技能的 30% 规范程度，仪器设备使用情的观察对不规范的操 掌握 况 作采取扣分制 平时 应取得了预期的实验 成绩 结果。如某个实验单 (80%) 考察学生每个实验步骤是 元失败而未能获得相 实验结果 20% 否取得了预期的结果 应的中间生物材料， 向实验教师索取相应 的材料，扣2分 教师根据学生上交的 考察原始数据是否翔实可 实验报告的规范性， 实验报告 20% 靠，数据是否处理实事求 分析及讨论的合理性 是，结果分析是否清晰可信 等进行打分
《生物技术制药》实验考核办法 考核内容包括实验预习、实验操作、实验设计、实验考试。要求学生每一步操作 都要规范、严谨，原始数据翔实可靠，数据处理实事求是，结果分析清晰可信。实验 结束后，进行讨论与总结，撰写实验报告，加深学生对原理的理解和掌握。准确、科 学地考核学生的知识、技术和能力，对综合素质提高起到导向作用。 学生本门实验课的最终成绩为平时成绩与实验设计成绩之和。考核采取多元评价 方式，考核内容主要有：平时成绩考核实验技能、实验态度、实验室常识等的掌握和 实验报告等方面；实验设计成绩考核学生的独立实验设计和实践过程，注重学生的创 新性思维及独立分析问题、解决问题能力等。 成绩 考核项目 分值 考核内容 考核方法 平时 成绩 （80%） 实验态度 10％ 考察学生在实验过程中的 出勤情况、对实验课的重视 程度、预习情况、对实验室 仪器设备的爱护以及与其 他同学的合作情况等 无故迟到一次扣 3 分； 无故旷课一次扣 10 分。 实验技能的 掌握 30％ 考察学生实验操作技术的 规范程度，仪器设备使用情 况 教师根据对学生操作 的观察对不规范的操 作采取扣分制 实验结果 20% 考察学生每个实验步骤是 否取得了预期的结果 应取得了预期的实验 结果。如某个实验单 元失败而未能获得相 应的中间生物材料， 向实验教师索取相应 的材料，扣 2 分 实验报告 20％ 考察原始数据是否翔实可 靠，数据是否处理实事求 是，结果分析是否清晰可信 教师根据学生上交的 实验报告的规范性， 分析及讨论的合理性 等进行打分
《生物技术制药》实验指导 教师根据设计的实验 设计方案和 考察学生自主设计的实验 10% 方案新颖，研究方案 实验 设计报告 的合理性和可行性 可行打分 设计 考察学生在实施过程中出 成绩 教师根据实验实施情 实验结果和 现问题时的分析解决能力、 (20%) 10% 况、实验数据和结果 分析报告 是否能达到预期结果、结果 打分 的分析是否合理 目 录 实验一细菌感受态的制备和质粒的转化 .2 实验二碱变性法提取质粒DNA 6 实验三水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 11 实验四DNA的限制性内切酶酶切 15 实验五DNA的回收与连接 18 实验六基因的PCR扩增 23 实验七用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因 29 实验八基因组合生物合成新化合物 36 实验九药用甘草片中甘草酸含量的分析及其质量评价 47 实验十牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备.… 48 实验十一固定化细胞法生产L天冬氨酸和L丙氨酸 50 实验十二重组水蛭素Ⅲ的制备 57 实验十三酸醇提取法制备猪胰岛素 65 实验十四多肽缩宫素的Fmoc固相合成法 70
《生物技术制药》实验指导 1 实验 设计 成绩 （20%） 设计方案和 设计报告 10％ 考察学生自主设计的实验 的合理性和可行性 教师根据设计的实验 方案新颖，研究方案 可行打分 实验结果和 分析报告 10％ 考察学生在实施过程中出 现问题时的分析解决能力、 是否能达到预期结果、结果 的分析是否合理 教师根据实验实施情 况、实验数据和结果 打分 目 录 实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化....................................................................... 2 实验二 碱变性法提取质粒 DNA ..................................................................................... 6 实验三 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA ............................................................... 11 实验四 DNA 的限制性内切酶酶切 ............................................................................... 15 实验五 DNA 的回收与连接 ........................................................................................... 18 实验六 基因的 PCR 扩增............................................................................................... 23 实验七 用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因................................................. 29 实验八 基因组合生物合成新化合物............................................................................. 36 实验九 药用甘草片中甘草酸含量的分析及其质量评价............................................... 47 实验十 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备............................................................... 48 实验十一 固定化细胞法生产 L-天冬氨酸和 L-丙氨酸.................................................. 50 实验十二 重组水蛭素Ⅲ的制备....................................................................................... 57 实验十三 酸醇提取法制备猪胰岛素............................................................................... 65 实验十四 多肽缩宫素的 Fmoc 固相合成法.................................................................... 70
《生物技术制药》实验指导 实验十五酵母RNA的制备和单核苷酸的离子交换柱层析分析….76 实验十六单核苷酸衍生物制备.… 82 实验十七胰弹性蛋白酶的制备及活力测定 85 实验十八超氧化物歧化酶的分离纯化 89 实验十九重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析 97 实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化 【实验目的】 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高 转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的 实验手段。 【实验原理】 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA,而导致其原来的遗传性状发生改变， 这种遗传性状包括遗传型和表型的改变
《生物技术制药》实验指导 2 实验十五 酵母 RNA 的制备和单核苷酸的离子交换柱层析分析................................. 76 实验十六 单核苷酸衍生物制备....................................................................................... 82 实验十七 胰弹性蛋白酶的制备及活力测定................................................................... 85 实验十八 超氧化物歧化酶的分离纯化........................................................................... 89 实验十九 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析................................................................... 97 实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化 【实验目的】 通过实验学会感受态细胞的制备方法和 DNA 转化的最基本操作，以及如何提高 转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的 实验手段。 【实验原理】 转化是指某一细胞系由于接受了外源 DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变， 这种遗传性状包括遗传型和表型的改变
《生物技术制药》实验指导 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCI2处理细菌，改 变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基 中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5,通过氨苄青霉素抗性筛选转化 :118/pUC119 cloning site pUC118/pUC119 (3,162bp) S-GAATTCGAGCTCGGTACCCOGOGATCCTCTAGAGTCOACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 1Ss683B71 -GCCAAGCTTOCATOCCTOCAOOTCOACTCTAOANGATCCCCOOOTACCOAOCTCOMAT SeeB387 1 S 子。 图1-1质粒pUC118/pUC119图谱 【实验材料和试剂】 (一)实验材料 大肠杆菌DH-5、质粒pUC118(ampicillin,AmpR) (二)培养基和试剂 1.LB液体培养基(%) 胰蛋白胨(Tryptone) 0.5 酵母浸出粉(Yeast extract) 1.0 NaCl 0.5 pH7.2~7.4(用2mol/L NaOH调节)
《生物技术制药》实验指导 3 感受态是受体菌能接受外源 DNA 能力的一种生理状态。用 CaCl2 处理细菌，改 变细胞膜的结构，使质粒 DNA 能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基 中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒 pUC118 转化大肠杆菌 DH- ，通过氨苄青霉素抗性筛选转化 子。 图 1-1 质粒 pUC118/pUC119 图谱 【实验材料和试剂】 （一）实验材料 大肠杆菌 DH- 、质粒 pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培养基和试剂 1. LB 液体培养基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.2～7.4（用 2mol/L NaOH 调节）
《生物技术制药》实验指导 (分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa高压 灭菌30分钟)。 2.LB固体培养基 LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。 (分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa高压灭 菌30分钟)。 3.抗生素：氨苄青霉素(ampicillin,Amp)）,配制成100mg/ml备用。 4.0.1mol/LCaC2溶液 配制方法称取1.1克无水CaCl2,溶于90ml蒸馏水中定容至100ml装于250ml 三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。 (三)器材 接种针、10ml移液管、50ml塑料离心管、5ml移液管、90mm培养皿、1ml移液 管、1.5 ml Eppendorf管、2001吸头、三角爬、15×150试管、冰块、试管铝帽、牛皮 纸、纱布盖、线绳、硫酸纸。 (四)仪器 净化工作台、摇床机、恒温水浴锅、离心机、培养箱 【实验步骤】 (一)感受态细胞的制备 1.大肠杆菌DH5冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平 板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。 2.从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3mlLB液体培养基的试管中， 37℃振荡培养过夜（约16小时）
《生物技术制药》实验指导 4 （分装：20ml/250ml 三角瓶，每组 2 瓶。3ml/试管，每组 2 管。0.07Mpa 高压 灭菌 30 分钟）。 2. LB 固体培养基 LB 液体培养基加入 1.6%的琼脂粉即可。 （分装：50ml/250ml 三角瓶，加入 0.8 克琼脂粉，每组 1 瓶。0.07Mpa 高压灭 菌 30 分钟）。 3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成 100mg/ml 备用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液 配制方法：称取 1.1 克无水 CaCl2，溶于 90ml 蒸馏水中，定容至 100ml，装于 250ml 三角瓶中，0.07Mpa 高压灭菌 30 分钟，4℃保存。 （三）器材 接种针、10ml 移液管、50ml 塑料离心管、5ml 移液管、90mm 培养皿、1ml 移液 管、1.5ml Eppendorf 管、200 l 吸头、三角爬、15×150 试管、冰块、试管铝帽、牛皮 纸、纱布盖、线绳、硫酸纸。 （四）仪器 净化工作台、摇床机、恒温水浴锅、离心机、培养箱 【实验步骤】 （一）感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌 DH- 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在 LB 固体培养基平 板上（活化菌种），37℃培养过夜（约 16 小时）。 2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有 3ml LB 液体培养基的试管中， 37℃振荡培养过夜（约 16 小时）
《生物技术制药》实验指导 3.取0.3ml菌液接种于20mlLB液体培养基的250ml三角瓶中37℃振荡培养2~ 3小时，待0D6oo值达到0.3~0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10~15分钟。 4.将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5.加入20ml用冰预冷的0.1mol/LCaC12溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中30分钟。 6.4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7.再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在4℃冰箱中放置12~24小时，即可应用于DNA转化。 (二)细菌的转化 1.取大肠杆菌DH-5新鲜感受态细胞1001于1.5 ml Eppendorf管中加入50~ 100ng质粒pUC118DNA,轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。 2.42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。 3.加入LB液体培养基9001,37℃保温60分钟。 4.取1001转化液涂布在含氨苄青霉素(（Amp)100gml的LB固体平板上， 37℃倒置培养16~24小时。 5.观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1.DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2.Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染
《生物技术制药》实验指导 5 3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～ 3 小时，待 OD600 值达到 0.3～0.4 时，取下三角瓶，立即置冰浴 10～15 分钟。 4. 将细菌转移到一个灭菌的 50ml 离心管中，4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5. 加入 20ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中 30 分钟。 6. 4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7. 再加入 2ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在 4℃冰箱中放置 12～24 小时，即可应用于 DNA 转化。 （二）细菌的转化 1. 取大肠杆菌 DH- 新鲜感受态细胞 于 1.5ml Eppendorf 管中，加入 50～ 100ng 质粒 pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置 30 分钟。 2. 42℃热休克 120 秒，不要摇动 Eppendorf 管。 3. 加入 LB 液体培养基 ，37℃保温 60 分钟。 4. 取 转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp） 的 LB 固体平板上， 37℃倒置培养 16～24 小时。 5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1. DNA 与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2. Eppendorf 管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染
《生物技术制药》实验指导 3.42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。 4.涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 实验二碱变性法提取质粒DNA 【实验目的】 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 【实验原理】 碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达 到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链 不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒 DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状 结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起 沉淀下来而被除去。 【实验材料和试剂】 (一)实验材料 6
《生物技术制药》实验指导 6 3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。 4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 实验二 碱变性法提取质粒 DNA 【实验目的】 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法。 【实验原理】 碱变性提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达 到分离目的。在 pH 高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链 不会完全分离，当以 pH4.8 的 NaAc 高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状 结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起 沉淀下来而被除去。 【实验材料和试剂】 （一）实验材料
《生物技术制药》实验指导 大肠杆菌DH-5（pUC118)（使用实验一转化平板上的菌)。 (二)培养基和试剂 1.LB液体培养基 同实验一。 2.抗生素：氨苄青霉素(ampicillin,.Amp）,配制成100mgml备用。 3.溶液1： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCI pH8.0 10mmol/L EDTA pH8.0) 2mg/ml 溶菌酶 4.溶液Ⅱ： 200mmol/L NaOH 1% SDS 5.溶液Ⅲ： 3mol/L NaAc（pH4.8)溶液 6.TE缓冲液： 10mmol/L Tris-HCI pH8.0 1mmol/L EDTA 7.预冷的无水乙醇 （三)器材 接种针、1ml移液管、1.5 ml Eppendorf管、2001吸头、冰块、牛皮纸、纱布盖、 线绳 (四)仪器 >
《生物技术制药》实验指导 7 大肠杆菌 DH- （pUC118）（使用实验一转化平板上的菌）。 （二）培养基和试剂 1. LB 液体培养基 同实验一。 2. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, Amp），配制成 100mg/ml 备用。 3. 溶液 I ： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 2mg/ml 溶菌酶 4. 溶液 II ： 200mmol/L NaOH 1% SDS 5. 溶液 III ： 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液 6. TE 缓冲液 ： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mmol/L EDTA 7. 预冷的无水乙醇 （三）器材 接种针、1ml 移液管、1.5ml Eppendorf 管、200 l 吸头、冰块、 牛皮纸、纱布盖、 线绳 （四）仪器