第五章 目的基因的分离
第五章 目的基因的分离
主要内容 二 基因克隆的目的与意义 基因文库技术 三、功能蛋白组技术 四、图位克隆法 五、mRNA差异显示法 六、转座子、T-DNA标签法 七、同源序列法 八、功能互补法 九、基因组扣除杂交法 十、酵母双杂交系统
主要内容 一、基因克隆的目的与意义 二、基因文库技术 三、功能蛋白组技术 四、图位克隆法 五、mRNA差异显示法 六、转座子、T-DNA标签法 七、同源序列法 八、功能互补法 九、基因组扣除杂交法 十、酵母双杂交系统
是否已知基因序列或 氨基酸序列信息 是 否 在本物种或其他物 在本物种或其他物种中 利用转座子T-DNA 利用分子标记 种中已克隆该基因 已知基因编码部分或全 插入创造突变体 定位目标基因 或有同源序列 长氨基酸序列 根据核苷酸或氨基酸序列 设计引物（或简并引物） 突变体库 基因定位图谱 以基因组DNA或CDNA 以扩增出的部分片段为探 转座子或T-DNA 利用BAC或YAC进 为模板PCR扩增 针筛选基因组或cDNA文库 标签法克隆 行图位克隆 目的基因
是 否 在本物种或其他物 种中已克隆该基因 或有同源序列 根据核苷酸或氨基酸序列 设计引物（或简并引物） 以基因组DNA或cDNA 为模板 PCR扩增 在本物种或其他物种中 已知基因编码部分或全 长氨基酸序列 以扩增出的部分片段为探 针筛选基因组或cDNA文库 转座子或T-DNA 标签法克隆 突变体库 基因定位图谱 利用BAC或YAC 进 行图位克隆 利用转座子T-DNA 插入创造突变体 利用分子标记 定位目标基因 是否已知基因序列或 氨基酸序列信息 目的基因
一、基因克隆的目的与意义 Isolation of gene of a gene enables the determination of its nucleotide sequence.From this information the internal landmarks of the gene can be determined for example,intron number and position;promoter elements. A comparison of DNA sequences between genes can lead to insights in gene evolution Converting the DNA sequence of a gene into amino acid sequence by using the genetic code leads to a determination of the structure of the protein product of the gene,and from this knowledge,the function of the gene can be inferred
一、基因克隆的目的与意义 • Isolation of gene of a gene enables the determination of its nucleotide sequence. From this information the internal landmarks of the gene can be determined – for example, intron number and position; promoter elements. • A comparison of DNA sequences between genes can lead to insights in gene evolution • Converting the DNA sequence of a gene into amino acid sequence by using the genetic code leads to a determination of the structure of the protein product of the gene, and from this knowledge, the function of the gene can be inferred
A gene can be moved from one organism to another.An organism containing a "foreign"gene via genetic engineering process is called transgenic. Transgenic organisms can be used either for laboratory research to advance our understanding of biological processes or for specialized industrial applications for examples: *Development of insect resistant crops *Production of human insulin in transgenic bacteria carrying appropriate human gene
• A gene can be moved from one organism to another. An organism containing a "foreign" gene via genetic engineering process is called transgenic. Transgenic organisms can be used either for laboratory research to advance our understanding of biological processes or for specialized industrial applications – for examples: *Development of insect resistant crops *Production of human insulin in transgenic bacteria carrying appropriate human gene
二、基因文库技术 1.基因文库的类别 基因文库（gene library)：是指某一生物类型全部基因的集合。 1.1基因组文库 1.2cDNA文库 1.3 3YAC文库(yeast artificial chromosomes library)酵母人工染色 体文库 1.4BAC文库(bacterial artificial chromosomes library)细菌人工染 色体文库 1.5 TAC (transformation-competent artificial chromosomes library)可转化人工染色体文库
二、基因文库技术 1. 基因文库的类别 基因文库（gene library）：是指某一生物类型全部基因的集合。 1.1 基因组文库 1.2 cDNA文库 1.3 YAC文库（yeast artificial chromosomes library）酵母人工染色 体文库 1.4 BAC文库（bacterial artificial chromosomes library ）细菌人工染 色体文库 1.5 TAC文库（transformation-competent artificial chromosomes library ）可转化人工染色体文库
2.基因组文库 2.1概述 ·基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割 成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成 的集合。 ·基因组文库根据DNA来源又可分为核基因组文库、 叶绿体基因组文库和线粒体基因组文库。 。 在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上 的所有编码区和非编码区序列的克隆
2. 基因组文库 2.1 概述 • 基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割 成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成 的集合。 • 基因组文库根据DNA来源又可分为核基因组文库、 叶绿体基因组文库和线粒体基因组文库。 • 在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上 的所有编码区和非编码区序列的克隆
2.1基因组DNA文库的构建 (1)载体的选择 1)入噬菌体载体 早期(70年代后期)使用，如Charon4A和λgt-WES,克隆15-20 kb。 目前用EMBL系列，入2001，入DASH,Charon38-40,入GEM-11等 置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb。 2)Cosmid载体 所有Cosmid载体均可用于构建文库，但建议尽量使用pJB8和c2RB, 因为经验较多，许多问题易于解决。克隆45kb
2.1 基因组DNA文库的构建 （1）载体的选择 1）λ 噬菌体载体 早期（70年代后期）使用，如Charon 4A和λ gt-WES，克隆15-20 kb。 目前用EMBL系列，λ 2001，λ DASH，Charon 38-40，λ GEM-11等 置换型载体，插入片段的最大值可达20-24 kb。 2）Cosmid载体 所有Cosmid载体均可用于构建文库，但建议尽量使用pJB8和c2RB， 因为经验较多，许多问题易于解决。克隆45 kb
(2)用入噬菌体构建文库 1)总DNA的提取 DNA初始长度应至少是用于克隆片段的4倍，否则有效片段较少， 因此DNA至少应>100kb(cosmid>200kb) 2)载体臂的制备 >购买 >载体制备、纯化 >限制酶消化BaI/EMBL xhol/Λgem11 >载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖或NaC1),梯度离心的收获量 大，而agarose回收量小。回收无填充片段，PG沉淀，除去碎片
（2）用λ 噬菌体构建文库 1）总DNA的提取 DNA初始长度应至少是用于克隆片段的4倍，否则有效片段较少， 因此DNA至少应>100 kb（cosmid>200 kb）。 2）载体臂的制备 购买 载体制备、纯化 限制酶消化 BamHI/EMBL Xhol/Λ gem11 载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖或NaCl），梯度离心的收获量 大，而agarose回收量小。回收无填充片段，PEG沉淀，除去碎片
3)基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24kb(agarose法或梯度离心) 有些载体可做不完全补平 4)连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成λ粘粒(4℃，6个月稳定) 5)扩增和保存 重组噬菌体可在E.co1i中扩增，所的文库可被长时间的利用和 贮存，可用于多个不同基因的筛选。 6)在宿主菌上形成噬菌斑 7)带有目的外源DNA序列的λ-phage.重组体的鉴定 8)对选出的重组ohage:进行噬菌斑纯化，在对外源DNA进行分析
3）基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24 kb（agarose法或梯度离心） 有些载体可做不完全补平 4）连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成λ 粘粒（4℃，6个月稳定） 5）扩增和保存 重组噬菌体可在E.coli中扩增，所的文库可被长时间的利用和 贮存，可用于多个不同基因的筛选。 6）在宿主菌上形成噬菌斑 7）带有目的外源DNA序列的λ -phage重组体的鉴定 8）对选出的重组phage进行噬菌斑纯化，在对外源DNA进行分析