实验二凝胶层析法测定蛋白质分子量 、实验目的 1.了解凝胶层析的原理及其应用。 2.通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。 、实验原理 凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于 分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重 要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来 分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排 阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见 理论部分的3.2凝胶层析一·节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶 颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排 阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小, 进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流 出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙 亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经 过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。 凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图3-5”。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其 被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系) 表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(vt)、外水体积(V)以及分离物本身的洗 脱体积(Ve)有关 Kav =(Ve-Vo)/(Vt-vo) (1) 在限定的层析条件下,Vt和V都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改 变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。 65页的“图3-6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积 (V)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的示意图 65页的“图3-7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的 个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分 离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V及Ve的值,从而 计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与 logMw(Mw 表示物质的分子量)成线性关系 C 其中b,C为常数 18181 实验二 凝胶层析法测定蛋白质分子量 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于 分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重 要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来 分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排 阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见 “理论部分的3.2 凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶 颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排 阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小， 进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流 出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙， 亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经 过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其 被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系） 表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗 脱体积（Ve）有关： Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1) 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改 变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。 65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积 （V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的示意图。 65页的“图 3－7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰。 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的 一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分 离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而 计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw 表示物质的分子量) 成线性关系： Kav ＝－b logMw + C --------- (2) 其中 b,C为常数