贵州医科大学学报 41卷 shRNA载体。在感染的细胞中,shNA序列能够 ev,2006(30):395-402 被加工成需要的 SiRNA,并稳定地传到子代细胞中4] Bernstein E, Caudy A, Hammond SM,etal. Role for a 发挥作用-6。RNA干扰技术现已在肿瘤发生、 bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA inter- ference[J]. Nature, 2001(18): 363-372 发展转移及肿瘤的耐药广泛应用(7-3有研究表[5] Fisherman M, Ketting, Plasterk RH. The genetics of 明利用RNA干扰技术干扰基因的表达后,会增加 RNA silencing[J]. Annu Rev Genet, 2002(36): 489 列腺癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌细胞等对抗癌药 物的敏感性9-1。课题组前期用洛铂处理宫颈癌[6] Brummelkamp TR, Bernards r, Agami R. Caski细胞,经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异 stable expression of short interfering RNAs in mammalian 表达蛋白,发现 hnRNA2/B1表达下调(21。hnRN els[J]. Science,2002(67):550-553. PA2/B基因能参与RNA的一系列生理活动和矿[7]田瑞敏鄢佳程,王含彦,等RNA干扰技术在肿瘤基 因治疗中的研究现状[J].重庆医学,2013(7):811 端粒以及端粒酶的调节,同时对细胞的分化和凋亡 也起到一定作用。特别是对端粒酶的影响非常8] Perry Jh, Emerald bs, Mertani hc,eta. The oncogenic 重要,参与了肿瘤细胞的凋亡{1, hnRNPA2/B1是 potential of growth hormone[J]. Growth Horm IGF Res 种原癌基因,有研究证实 hnRNA2/B1基因在多 2006(5-6):277-289 种癌症中均高表达,干扰 hnRNA2/B会增加抗癌[9]clc, Dowling C, ONeill AJ, et al. Effects of clAP-I clAP-2 and XIAP triple knockdown on prostate cancer 药物对胰腺癌细胞的敏感性, hnRNA2/B1的表达 cell susceptibility to apoptosis, cell survival and prolifera- 降低,抑制肿瘤形成-。利用慢病毒构建的 [J]. Mol cancer,2009(8):39-4 shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于[101] Nozawa h, Tadakuma T,onoT,etal. Small interfering 感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞, RNA targeting epidermal growth factor receptor enhances 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后 chemosensitivity to cisplatin, 5-fluorouracil and docetaxel 可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳 in head and neck squamous cell carcinoma[ J].Cancer Sci,2006(10):1115-1124. 定表达。本研究用含 hnRNA2/B1的 shRNA[11 Fujioka S,sonk, Onda S,etl. Desensitization of 与 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体连接,构建含靶向 hnRNA2/ BI shRNA的重组慢病毒载体,期望为研 ancer cells to TNF-alpha or paclitaxel [J]. Anticancer 究 hnRNA2/B1基因的作用及分子机制奠定基础。 Res,2012(11):4813-4821 本研究设计的4个靶点 ShIRA及1个阴性对照21AhA., Muerkoster s,shrH. targeting ap oligo dna经过测序并经 BLAST对比证实了插入 pathways in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2013 (2):346-358 慢病毒中的干扰序列的方向和序列。将构建的慢[1]Les, Yoon cy, Byun ss,ta. The role of c-flip in 病毒载体和包装质粒共同转染HEK293T细胞,成 Cisplatin Resistance of Human Bladder Cancer Cells[J] 功并且获得高浓度的病毒颗粒 J Urol,2013(6):2327-2334 综上,本研究成功构建高浓度的 hnRNA2/B1[14] Sinha p, Poland j. kohl S,tal. Study of the development shRNA慢病毒载体,为研究 hnRNA2/B1基因的 of chemoresistance in melanoma cell line using proteome 作用及分子机制奠定基础。 analysis[J]. Electrophoresis, 2003(14): 2386-2404 [15]Golan-Gerstl R, Cohen 4参考文献 hnRNPA2/BI regulates tumor suppressor gene splicing neogenic driver in glioblastoma[J].Cancer [1 Shekhar MP. Drug resistance: challenges to effectiv es,2011(13):4 therapy[ J]. Curr Cancer Drug Targets, 2011(5): 613-[16]Gu WJ, Liu HL, Liu WH, et al. Induction of pancreatic ancer cell apoptosis, invasion, migration, and enthance- 2]Li XQ, Ran L, Fang W. Lobaplatin arrests cell cycle pro- ment of chemotherapy sensitivity of gemcitabine, 5-FU gression,induces apoptosis and alters the proteome in h and oxaliplation by hnRNPA2/BI siRNA [J]. Anti r cell Line CaSki[ j]. Biomedicine er durgs,2013(6):566-576 Pharmacotherapy, 2014(3 ): 291-297 [17 ]Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: Basic [3] Zech VF, Dlaska M, Tzankov A, et al. Prognostic and di- to translational[ J]. Biochem J, 2012(3): 603-618 agnostic relevance of hnRNPA2/BI hnRNPBl and S100 (2016-03-28收稿,2016-05-19修回) A2 in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Detect 中文编辑:吴昌学;英文编辑:刘华 634ｓｈＲＮＡ载体。在感染的细胞中，ｓｈＲＮＡ序列能够 被加工成需要的 ｓｉＲＮＡ，并稳定地传到子代细胞中 发挥作用［５－６］ 。ＲＮＡ干扰技术现已在肿瘤发生、 发展转移及肿瘤的耐药广泛应用［７－８］ 。有研究表 明利用 ＲＮＡ干扰技术干扰基因的表达后，会增加 列腺癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌细胞等对抗癌药 物的敏感性［９－１３］ 。课题组前期用洛铂处理宫颈癌 Ｃａｓｋｉ细胞，经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异 表达蛋白，发现 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１表达下调［２］ 。ｈｎＲＮ ＰＡ２／Ｂ１基因能参与 ＲＮＡ的一系列生理活动和对 端粒以及端粒酶的调节，同时对细胞的分化和凋亡 也起到一定作用［３］ 。特别是对端粒酶的影响非常 重要，参与了肿瘤细胞的凋亡［１４］ ，ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１是 一种原癌基因，有研究证实 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因在多 种癌症中均高表达，干扰 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１会增加抗癌 药物对胰腺癌细胞的敏感性，ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１的表达 降低，抑制肿瘤形成［１５－１６］ 。利用慢病毒构建的 ｓｈＲＮＡ克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于 感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞， 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后 可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳 定表达［１７］ 。本研究用含 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１的 ｓｈＲＮＡ 与 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，构建含靶向 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ的重组慢病毒载体，期望为研 究 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的作用及分子机制奠定基础。 本研究设计的 ４个靶点 ＳｈＮＲＡ及 １个阴性对照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ经过测序并经 ＢＬＡＳＴ对比证实了插入 慢病毒中的干扰序列的方向和序列。将构建的慢 病毒载体和包装质粒共同转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，成 功并且获得高浓度的病毒颗粒。 综上，本研究成功构建高浓度的 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，为研究 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的 作用及分子机制奠定基础。 ４ 参考文献 ［１］ ＳｈｅｋｈａｒＭＰ．Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｔｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＣｕｒｒＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，２０１１（５）：６１３－ ６２３． ［２］ＬｉＸＱ，ＲａｎＬ，ＦａｎｇＷ．Ｌｏｂａｐｌａｔｉｎａｒｒｅｓｔｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｒｏ ｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｌｔｅｒｓｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｈｕ ｍａｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＬｉｎｅＣａＳｋｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１４（３）：２９１－２９７． ［３］ＺｅｃｈＶＦ，ＤｌａｓｋａＭ，ＴｚａｎｋｏｖＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｎｄｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｒｅｌｅｖａｎｃｅｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１，ｈｎＲＮＰＢ１ａｎｄＳ１００ Ａ２ｉｎｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔ ｐｒｅｖ，２００６（３０）：３９５－４０２． ［４］ＢｅｒｎｓｔｅｉｎＥ，ＣａｕｄｙＡＡ，ＨａｍｍｏｎｄＳＭ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｆｏｒａ ｂｉｄｅｎｔａｔｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｔｅｐｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒ ｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１（１８）：３６３－３７２． ［５］ＴｉｊｓｔｅｒｍａｎＭ，ＫｅｔｔｉｎｇＲＦ，ＰｌａｓｔｅｒｋＲＨ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＧｅｎｅｔ，２００２（３６）：４８９－ ５１９． ［６］ＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐＴＲ，ＢｅｒｎａｒｄｓＲ，ＡｇａｍｉＲ．Ａｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２（６７）：５５０－５５３． ［７］田瑞敏，鄢佳程，王含彦，等．ＲＮＡ干扰技术在肿瘤基 因治疗中的研究现状［Ｊ］．重庆医学，２０１３（７）：８１１ －８１４． ［８］ＰｅｒｒｙＪＫ，ＥｍｅｒａｌｄＢＳ，ＭｅｒｔａｎｉＨＣ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ［Ｊ］．ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍＩＧＦＲｅｓ， ２００６（５－６）：２７７－２８９． ［９］ＧｉｌｌＣ，ＤｏｗｌｉｎｇＣ，Ｏ＇ＮｅｉｌｌＡＪ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃＩＡＰ１， ｃＩＡＰ２ａｎｄＸＩＡＰｔｒｉｐｌｅｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａ ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌＣａｎｃｅｒ，２００９（８）：３９－４７． ［１０］ＮｏｚａｗａＨ，ＴａｄａｋｕｍａＴ，ＯｎｏＴ，ｅｔａｌ．Ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｃｉｓｐｌａｔｉｎ，５ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌａｎｄｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，２００６（１０）：１１１５－１１２４． ［１１］ＦｕｊｉｏｋａＳ，ＳｏｎＫ，ＯｎｄａＳ，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆ ＮＦｋａｐｐａＢｆｏｒｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｏＴＮＦａｌｐｈａｏｒｐａｃｌｉｔａｘｅｌ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２（１１）：４８１３－４８２１． ［１２］ＡｒｌｔＡ，ＭｕｅｒｋｏｓｔｅｒＳＳ，ＳｃｈａｆｅｒＨ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ，２０１３ （２）：３４６－３５８． ［１３］ＬｅｅＳ，ＹｏｏｎＣＹ，ＢｙｕｎＳＳ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆｃＦＬＩＰｉｎ ＣｉｓｐｌａｔｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＨｕｍａｎＢｌａｄｄｅｒＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ［Ｊ］． ＪＵｒｏｌ，２０１３（６）：２３２７－２３３４． ［１４］ＳｉｎｈａＰ，ＰｏｌａｎｄＪ，ｋｏｈｌＳ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３（１４）：２３８６－２４０４． ［１５］ＧｏｌａｎＧｅｒｓｔｌＲ，ＣｏｈｅｎＭ，ＳｈｉｌｏＡ，ｅｔａｌ．Ｓｐｌｉｃｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄｉｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃｄｒｉｖｅｒｉｎｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１（１３）：４４６４－４４７２． ［１６］ＧｕＷＪ，ＬｉｕＨＬ，ＬｉｕＷＨ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｎｔｈａｎｃｅ ｍｅｎｔｏｆｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，５ＦＵ ａｎｄｏｘａｌｉｐｌａｔｉｏｎｂｙｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｉＲＮＡ ［Ｊ］．Ａｎｔｉ ｃａｎｃｅｒｄｕｒｇｓ，２０１３（６）：５６６－５７６． ［１７］ＳａｋｕｍａＴ，ＢａｒｒｙＭＡ，ＩｋｅｄａＹ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ ｔｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２０１２（３）：６０３－６１８． （２０１６－０３－２８收稿，２０１６－０５－１９修回） 中文编辑：吴昌学；英文编辑：刘 华 ４３６ 贵 州 医 科 大 学 学 报 ４１卷