亲和层析。亲和层析是另一种有效的蛋白质纯化技术。该技术利用蛋白质对特定化学基团的 高度亲和性进行蛋白质纯化。例如，共价连接了葡萄糖的层析柱能用来从植物抽提液纯化植 物蛋白质刀豆素A(图3.5)。因为刀豆素A与葡萄糖的亲和性很高，而其他蛋白质与葡萄糖 的亲和性很低。植物蛋白抽提液流过这样的层析柱，只有刀豆素A结合到层析柱上，其它 蛋白质统统流出。然后用含有葡萄糖的层析溶液将将刀豆素A洗出。液相葡萄糖能替代固 相葡萄糖，使刀豆素A从固相洗下（图3.5）。亲和层析也是分离转录因子的有效技术。转 录因子能够与特定DNA序列结合，调节基因转录(39章和31章)。蛋白质混合物流过共价 交联了DNA的层析柱，那些与该DNA序列亲和性高的蛋白质组分将滞留在柱上。然后用 高浓度盐溶液将柱上结合的蛋白质洗出。 Glucose-binding Glucose-binding protein attaches proteins are to glucose released on residues (G)on addition of beads Addition of glucose glucose(G) GG GG Figure 3-5 Biochemistry,Sixth Edition 2007 W.H.Freeman and Company 图3.5亲和层析。用交联了葡萄糖(G)的固相载体亲和层析纯化刀豆素A(黄色)。 亲和层析纯化蛋白质的方法是(1)先将蛋白质识别的基团X或者X的衍生物共价交联 于固相载体上，然后将这种固相载体装入层析柱；(2)将蛋白质混合物流过这种亲和柱，并 用结合缓冲液洗涤除去不结合蛋白质；(3)用高浓度X溶液、或者用能够降低蛋白质与X 亲和力的缓冲液洗柱，将目标蛋白质洗出。如果蛋白质与X分子（即诱饵分子）相互作用 具有高度特异性，那么亲和层析是一种非常有效地纯化蛋白质技术。 如果纯化重组蛋白质(52节)，也可以更改上述的亲和纯化方案。此时修改编码基因， 使基因还编码一段额外的氨基酸序列，这段额外的氨基酸序列充当充当亲和层析标签用于亲 和纯化。例如，一串组氨酸（即Hs标签）可以添加到表达蛋白质的C-端或N-端。有标签 的蛋白质流过共价交联了N+或其它金属离子的固相载体。Hs标签与固相金属离子紧密结 合，导致表达蛋白质也与载体紧密结合。那些没有HS标签的蛋白质不能与固相载体结合， 直接从亲和柱流出。加入咪唑或其它化学物质溶液，能够与金属离子结合从而将带有Hs 标签的蛋白质洗出。 高压液相层析。高压液相层析是上述柱层析技术的加强型。层析柱的固相载体介质更细， 因此与蛋白质相互作用的位点更多，分辨率更高。由于载体介质更细，因此需要更大的压力 才能获得足量的流速。最终的结果是HPLC的分辨率高，分离所需的时间短（图3.6）。亲和层析。亲和层析是另一种有效的蛋白质纯化技术。该技术利用蛋白质对特定化学基团的 高度亲和性进行蛋白质纯化。例如，共价连接了葡萄糖的层析柱能用来从植物抽提液纯化植 物蛋白质刀豆素 A(图 3.5)。因为刀豆素 A 与葡萄糖的亲和性很高，而其他蛋白质与葡萄糖 的亲和性很低。植物蛋白抽提液流过这样的层析柱，只有刀豆素 A 结合到层析柱上，其它 蛋白质统统流出。然后用含有葡萄糖的层析溶液将将刀豆素 A 洗出。液相葡萄糖能替代固 相葡萄糖，使刀豆素 A 从固相洗下（图 3.5）。亲和层析也是分离转录因子的有效技术。转 录因子能够与特定 DNA 序列结合，调节基因转录（39 章和 31 章）。蛋白质混合物流过共价 交联了 DNA 的层析柱，那些与该 DNA 序列亲和性高的蛋白质组分将滞留在柱上。然后用 高浓度盐溶液将柱上结合的蛋白质洗出。 图 3.5 亲和层析。用交联了葡萄糖（G）的固相载体亲和层析纯化刀豆素 A(黄色)。 亲和层析纯化蛋白质的方法是（1）先将蛋白质识别的基团 X 或者 X 的衍生物共价交联 于固相载体上，然后将这种固相载体装入层析柱；（2）将蛋白质混合物流过这种亲和柱，并 用结合缓冲液洗涤除去不结合蛋白质；（3）用高浓度 X 溶液、或者用能够降低蛋白质与 X 亲和力的缓冲液洗柱，将目标蛋白质洗出。如果蛋白质与 X 分子（即诱饵分子）相互作用 具有高度特异性，那么亲和层析是一种非常有效地纯化蛋白质技术。 如果纯化重组蛋白质（5.2 节），也可以更改上述的亲和纯化方案。此时修改编码基因， 使基因还编码一段额外的氨基酸序列，这段额外的氨基酸序列充当充当亲和层析标签用于亲 和纯化。例如，一串组氨酸（即 His 标签）可以添加到表达蛋白质的 C-端或 N-端。有标签 的蛋白质流过共价交联了 Ni2+或其它金属离子的固相载体。His 标签与固相金属离子紧密结 合，导致表达蛋白质也与载体紧密结合。那些没有 His 标签的蛋白质不能与固相载体结合， 直接从亲和柱流出。加入咪唑或其它化学物质溶液，能够与金属离子结合从而将带有 His 标签的蛋白质洗出。 高压液相层析。高压液相层析是上述柱层析技术的加强型。层析柱的固相载体介质更细， 因此与蛋白质相互作用的位点更多，分辨率更高。由于载体介质更细，因此需要更大的压力 才能获得足量的流速。最终的结果是 HPLC 的分辨率高，分离所需的时间短（图 3.6）