,210 北京科技大学学报 2007年增刊2 其与雌激素受体结合后放射性活度的变化来评价雌 (a) b () 激素受体的配体结合活性[)].这种方法虽然准确度 高，但是由于试剂昂贵，且需要进行放射性操作，所 以一般实验室难以进行，本研究中，建立了一种简单 EEE 方便的对雌激素受体的配体结合活性进行评价的方 法，即利用雌激素受体、或其配体结合片段与共价连 接在牛血清白蛋白(BSA)上的雌二醇结合后，新生 成的复合物分子量发生很大变化的特点，利用非变 性电泳进行分离，利用银染法进行蛋白检测的技术， 研究了hERB LBD蛋白与E2BSA的结合活性（图 4).图4中1,2,3依次为Es-BSA(100ngL)、 ERP(100ngL-1)、两者的过夜混合物，加样量均 为20L·结果显示，二者充分反应后，hERB LBD 蛋白与E2BSA的电泳条带均显著减弱，其中hERB LBD蛋白的条带几乎完全消失，而hERB LBD电 图2不同培养条件对hERB-LBD蛋白表达的影响 泳带中上部的两条杂蛋白条带没有明显变化，这说 明，hER B LBD蛋白与E2BSA的E2-基团发生了 菌可溶蛋白中目标蛋白质的表达量即达到最高值， 特异性结合反应，即通过异源表达方法制备的hER 对于增加培养时间目标蛋白质的表达量无明显变化 一HBD蛋白具有雌激素配体结合活性，同时，这也 (图2(c)·因此，本研究优化重组大肠杆菌培养条 证明了建立的对雌激素受体的配体结合活性进行评 件为：诱导剂PTG使用浓度0.2 mmol .L-1,培养 价的电泳方法是可行的 温度25℃，诱导培养时间8h.在优化条件下，经亲 色谱纯化后，最高目标蛋白表达量达到236mg· L-1 由于本研究中所表达的重组蛋白含一段“组氨 酸”标签(His一ag),因此可以用Ni亲和层析柱将重 组蛋白选择性萃取.利用亲和层析法纯化了细胞破 壁后上清液中的hERP-LBD蛋白，并用SDS一 PAGE对蛋白纯度进行了鉴定，结果如图3所示，其 中1为hERB-LBD蛋白；2为marker,纯化后 hERB-LBD蛋白的相对分子量为30kD,对电泳图 扫描分析后显示，蛋白纯度大于90%. 图4非变性电泳检测hERB-LBD蛋白的配体结合活性 97.4kD 66.2 3结论 43.0 本文成功构建了可分泌hERB LBD蛋白的重 31.0 组大肠杆菌，优化了表达条件，在诱导剂(IPTG)浓 度为0.2 nmolL-1,诱导温度25℃，诱导时间为8h 20.1 的条件下，hERB-LBD蛋白表达量最多.利用亲和 色谱法纯化了hERB-LBD蛋白，蛋白纯度达90% 图3纯化后hERB-LBD蛋白的SDS-PAGE分析 以上，并初步建立了评价雌激素受体配体结合活性 是否具有雌激素配体结合活性是评价异源表达 的电泳方法，利用该方法证明本研究所获得的雌激素 雌激素受体蛋白成功与否的关键指标，目前，绝大 受体蛋白配体结合片段具有雌激素结合活性，可以用 多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为配体，通过 于研究环境化合物与雌激素受体的相互作用研究，图2 不同培养条件对 hERβ－LBD 蛋白表达的影响 菌可溶蛋白中目标蛋白质的表达量即达到最高值‚ 对于增加培养时间目标蛋白质的表达量无明显变化 （图2（c））．因此‚本研究优化重组大肠杆菌培养条 件为：诱导剂 IPTG 使用浓度0∙2mmol·L －1‚培养 温度25℃‚诱导培养时间8h．在优化条件下‚经亲 和色谱纯化后‚最高目标蛋白表达量达到236mg· L －1． 由于本研究中所表达的重组蛋白含一段“组氨 酸”标签（His－tag）‚因此可以用 Ni 亲和层析柱将重 组蛋白选择性萃取．利用亲和层析法纯化了细胞破 壁后上清液中的 hERβ－LBD 蛋白‚并用 SDS－ PAGE 对蛋白纯度进行了鉴定‚结果如图3所示‚其 中1 为 hERβ－LBD 蛋白；2 为 marker．纯化后 hERβ－LBD 蛋白的相对分子量为30kD‚对电泳图 扫描分析后显示‚蛋白纯度大于90％． 图3 纯化后 hERβ－LBD 蛋白的 SDS－PAGE 分析 是否具有雌激素配体结合活性是评价异源表达 雌激素受体蛋白成功与否的关键指标．目前‚绝大 多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为配体‚通过 其与雌激素受体结合后放射性活度的变化来评价雌 激素受体的配体结合活性［7］．这种方法虽然准确度 高‚但是由于试剂昂贵‚且需要进行放射性操作‚所 以一般实验室难以进行．本研究中‚建立了一种简单 方便的对雌激素受体的配体结合活性进行评价的方 法‚即利用雌激素受体、或其配体结合片段与共价连 接在牛血清白蛋白（BSA）上的雌二醇结合后‚新生 成的复合物分子量发生很大变化的特点‚利用非变 性电泳进行分离‚利用银染法进行蛋白检测的技术‚ 研究了 hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的结合活性（图 4）．图4中1‚2‚3依次为 Es－BSA（100ng·μL －1）、 ERβ（100ng·μL －1）、两者的过夜混合物‚加样量均 为20μL．结果显示‚二者充分反应后‚hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的电泳条带均显著减弱‚其中 hERβ －LBD 蛋白的条带几乎完全消失‚而 hERβ－LBD 电 泳带中上部的两条杂蛋白条带没有明显变化．这说 明‚hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的 E2－基团发生了 特异性结合反应‚即通过异源表达方法制备的 hER －LBD 蛋白具有雌激素配体结合活性．同时‚这也 证明了建立的对雌激素受体的配体结合活性进行评 价的电泳方法是可行的． 图4 非变性电泳检测 hERβ－LBD 蛋白的配体结合活性 3 结论 本文成功构建了可分泌 hERβ－LBD 蛋白的重 组大肠杆菌．优化了表达条件‚在诱导剂（IPTG）浓 度为0∙2mmol·L －1‚诱导温度25℃‚诱导时间为8h 的条件下‚hERβ－LBD 蛋白表达量最多．利用亲和 色谱法纯化了 hERβ－LBD 蛋白‚蛋白纯度达90％ 以上．并初步建立了评价雌激素受体配体结合活性 的电泳方法‚利用该方法证明本研究所获得的雌激素 受体蛋白配体结合片段具有雌激素结合活性‚可以用 于研究环境化合物与雌激素受体的相互作用研究． ·210· 北 京 科 技 大 学 学 报 2007年 增刊2