雌激素受体ERβ配体结合区的异源表达与纯化

为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用,在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体ERβ的配体结合区(hERβ-LBD)蛋白。在诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol·L-1,培养温度25℃,诱导时间为8h的优化表达条件下,经亲和色谱法纯化后,hERβ(LBD蛋白的产量可达236mg·L-1.

团购合买资源类别：文库，文档格式：PDF，文档页数：4，文件大小：495.42KB

D0I:10.13374/1.issnl00103.2007.s2.087 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 Suppl.2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dee.2007 雌激素受体ER阝配体结合区的异源表达与纯化时国庆郭彦峰魏巍宋青张怀钟广蓉北京科技大学应用科学学院，北京100083 摘要为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用，在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体ER阝的配体结合区(hERB一 LBD)蛋白。在诱导剂(PTG)浓度为0.2 mmol L-1,培养温度25℃，诱导时间为8h的优化表达条件下，经亲和色谱法纯化后，hER(LBD蛋白的产量可达236mgL-1. 关键词雌激素受体：配体结合区：表达：纯化分类号Q591.1+1 环境污染物对健康的影响是人们普遍关注的问 1 题，近年来，越来越多的曾被认为“安全”而广泛使材料与方法用的化合物被证明具有雌激素或抗雌激素活性，能 1.1材料够引起一系列雌激素依赖的生理、生化过程紊乱，导表达hER B LBD编码序列（带His tag)的质粒致实验或野生动物的胚胎发育异常、生殖能力下降、蒙美国芝加哥大学Greene G,L·教授惠赠.E,coli 性别分化异常等现象山.虽然这些化合物对生物体 BL21(DE3)购于北京鼎国生物技术有限责任公司，的作用途径、生物效应各不相同，但一般都需要与雌细菌培养用胰化蛋白胨和细菌培养专用酵母提取物激素受体发生相互作用)]. 购于OXOID公司，His Bind Purification Kit和Pro 在生物体内，雎激素与雌激素受体的相互作用 tease Inhibitor Cocktail SetⅡ分别为Novagen公司机制一般为)]：首先雌激素与雌激素受体结合，然和Calbiochem公司产品·其它生化试剂均为Sigma 后受体蛋白形成二聚体，最后此二聚体与目标基因公司产品上的雎激素响应元素(estrogen response element, 1.2质粒的转化 ERE)结合，激活目标基因的表达，使细胞产生相应将含ERB质粒的溶液(1O0L)转移到含感受生理响应，从雌激素受体蛋白的N端到C端包括6 态细胞的CaCl2溶液(100L,0.1molL1)的中，冰个不同的结构域，依次命名为A下，结构域E有配浴30min,于42℃水浴放置90s,再入冰浴，加入LB 体结合功能，称为配体结合区((ligand binding do~ 液体培养基500L,混匀后振荡培养(100rmim1, main,LBD)·为研究方便，通常用异源表达的LBD 37℃)45mim,最后将上述菌液涂固体LB平板，37 蛋白研究配体与受体的相互作用[3)，生物体内主要 ℃过夜. 有两种不同的雌激素受体蛋白，分别称为ERα和 1.3ERB的表达 ERB.不同组织中ERQ和ERB的比例不同，对配体将ERB质粒转化的宿主菌接种于含Amp十的亲和活性及转录活性也不相同].ER3于1996 (100gmL)的液体LB培养基(5mL),过夜培养年被首次报道可，由于发现较晚，其与环境污染物 (37℃，200rmin)过夜培养物按4%接种比接种的相互作用机制尚不清楚，为此，本文研究了利用到含Amp十(100gmL-1)5mL液体LB培养基，大肠杆菌异源表达hERB LBD蛋白的方法，优化了通气培养(37℃，200rmin-1),用分光光度计检测表达条件，为进一步研究环境化合物与ERP的相互菌液在600nm下的吸光度值(OD),菌液OD值为作用奠定了基础 0.5~0.7时，吸出1mL的培养物作为电泳的对照，剩余的培养物加PTG(1 mmol L),诱导产生蛋白，时间3h.菌液离心(12000rmin1,1min),Tris 收稿日期：2007-08-15 HCl缓冲液(0.02molL1,pH7.5)重悬后破碎细基金项目：国家自然科学基金资助项目(N。20507002) 胞，12000rmin离心20min,将上清液与2×SDS- 作者简介：时国庆(1972-)，男，副教授 PAGE样品溶解液1：1混合，沸水浴3min后，冰浴

雌激素受体 ERβ配体结合区的异源表达与纯化时国庆郭彦峰魏巍宋青张怀钟广蓉北京科技大学应用科学学院北京100083 摘要为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体 ERβ的配体结合区（hERβ－ LBD）蛋白。在诱导剂（IPTG）浓度为0∙2mmol·L －1培养温度25℃诱导时间为8h 的优化表达条件下经亲和色谱法纯化后hERβ（LBD 蛋白的产量可达236mg·L －1．关键词雌激素受体；配体结合区；表达；纯化分类号 Q591∙1＋1 收稿日期：2007-08-15 基金项目：国家自然科学基金资助项目（No．20507002）作者简介：时国庆（1972－）男副教授环境污染物对健康的影响是人们普遍关注的问题．近年来越来越多的曾被认为“安全”而广泛使用的化合物被证明具有雌激素或抗雌激素活性能够引起一系列雌激素依赖的生理、生化过程紊乱导致实验或野生动物的胚胎发育异常、生殖能力下降、性别分化异常等现象［1］．虽然这些化合物对生物体的作用途径、生物效应各不相同但一般都需要与雌激素受体发生相互作用［1－2］．在生物体内雌激素与雌激素受体的相互作用机制一般为［2］：首先雌激素与雌激素受体结合然后受体蛋白形成二聚体最后此二聚体与目标基因上的雌激素响应元素（estrogen response element ERE）结合激活目标基因的表达使细胞产生相应生理响应．从雌激素受体蛋白的 N 端到 C 端包括6 个不同的结构域依次命名为 A－F结构域 E 有配体结合功能称为配体结合区（ligand binding domainLBD）．为研究方便通常用异源表达的 LBD 蛋白研究配体与受体的相互作用［3］．生物体内主要有两种不同的雌激素受体蛋白分别称为 ERα和 ERβ．不同组织中 ERα和 ERβ的比例不同对配体的亲和活性及转录活性也不相同［4］．ERβ于1996 年被首次报道［5］由于发现较晚其与环境污染物的相互作用机制尚不清楚．为此本文研究了利用大肠杆菌异源表达 hERβ－LBD 蛋白的方法优化了表达条件为进一步研究环境化合物与 ERβ的相互作用奠定了基础． 1 材料与方法 1∙1 材料表达 hERβ－LBD 编码序列（带 His－tag）的质粒蒙美国芝加哥大学 Greene G．L．教授惠赠．E．coli BL21（DE3）购于北京鼎国生物技术有限责任公司．细菌培养用胰化蛋白胨和细菌培养专用酵母提取物购于 OXOID 公司His Bind Purification Kit 和 Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅱ分别为 Novagen 公司和 Calbiochem 公司产品．其它生化试剂均为 Sigma 公司产品． 1∙2 质粒的转化将含 ERβ质粒的溶液（100μL）转移到含感受态细胞的 CaCl2 溶液（100μL0∙1mol·L －1）的中冰浴30min于42℃水浴放置90s再入冰浴加入 LB 液体培养基500μL混匀后振荡培养（100r·min －1 37℃）45min最后将上述菌液涂固体 LB 平板37 ℃过夜． 1∙3 ERβ的表达将ERβ质粒转化的宿主菌接种于含 Amp＋（100μg·mL －1）的液体 LB 培养基（5mL）过夜培养（37℃200r·min －1）过夜培养物按4％接种比接种到含 Amp＋（100μg·mL －1）5mL 液体 LB 培养基通气培养（37℃200r·min －1）用分光光度计检测菌液在600nm 下的吸光度值（OD）菌液 OD 值为 0∙5～0∙7时吸出1mL 的培养物作为电泳的对照剩余的培养物加 IPTG（1mmol·L －1）诱导产生蛋白时间3h．菌液离心（12000r·min －11min）Tris－ HCl 缓冲液（0∙02mol·L －1pH7∙5）重悬后破碎细胞12000r·min －1离心20min将上清液与2×SDS－ PAGE 样品溶解液1∶1混合沸水浴3min 后冰浴第29卷增刊2 2007年 12月北京科技大学学报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29Suppl．2 Dec．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．s2．087

Vol.29 Suppl.2 时国庆等：雌激素受体E阝配体结合区的异源表达与纯化 ·209, 冷却.分别用12%SDS-PAGE分离诱导及未诱导 min-1,10min),取上清液，用12%非变性聚丙烯酰样品，检测表达效果，胺凝胶电泳分离.加样量为20L·孔1，以E2- 1.4融合蛋白表达条件的优化 BSA,hER B LBD蛋白作为对照.银染法检测蛋白 (1)诱导剂浓度的优化，接菌到100mL培养质基，0D为0.5~0.7时加入IPTG,使其浓度分别为 0.1,0.2,0.4,0.6 mmol .L-1,培养3h(37℃，200r. 2结果与讨论 min1),室温离心(10000rmin1,10min)弃上清将人工构造hERB LBD质粒转移到大肠杆菌液.把每种沉淀重悬于结合缓冲液中(0.5mlL-1 感受态细胞中，在LB平板上涂板并过夜培养后，有 NaCl,20 mmol .L-Tris-HCl,5 mmol .L-1吲唑，白色菌落出现，证明hERB LBD表达质粒已转化到 pH7.9,每100mL培养基10mL缓冲液)，用超声波宿主细胞中，对经IPTG诱导和未经诱导的重组菌破碎仪破碎细胞（功率450W,工作时间3s,间隔时可溶性蛋白进行电泳分析（图1，其中，1为未经诱导间3s,总时间6min)将破碎液离心后(12000r· 的hERBLBD重组菌；2为经诱导的hERB-LBD min-1,20mim),分离沉淀及上清，用12%sDS一重组菌)表明，经IPTG诱导后，重组细菌中有较强 PAGE分离可溶蛋白，用软件“电泳图谱制作器的蛋白表达，其分子量约30kD,与根据氨基酸序列 V1.0绘制电泳图谱，检测表达效果. 计算出的hERB配体结合区蛋白分子量相近，而 (2)诱导温度的优化，接菌到100mL培养基，未经诱导的细菌中没有该蛋白条带，证明重组大肠 0D为0.5~0.7时加入IPTG,工作浓度为0.2 杆菌细胞中有hERB LBD蛋白合成， mmol.L-1,200rmin-振荡培养3h,诱导温度分别为15,20,25,30℃，室温离心(10000rmin-1,10 97.4kD min)弃上清液，用上述方法破碎细胞，检验表达效 662- 果 43.0- (3)诱导时间的优化，接菌到100mL培养基， 31.0- hER 0D为0.5~0.7时加入IPTG,工作浓度为0.2 B-LBD mmol-L-1,温度25℃，振荡培养时间为：8,12,20， 20.1 24h,室温离心(10000rmin-1,10min)弃上清液 14.4 用上述方法破碎细胞，检验表达效果， 1.5融合蛋白的纯化按1.4节的方法收集细菌，加入蛋白酶抑制剂，图1 hERBLBD和hERBBD基因重组大肠杆菌可溶性蛋白电泳图经超声破碎后离心取上清，依次用3倍体积去离子水，5倍体积NiS04(0.05molL-1),3倍体积结合为了提高hER LBD蛋白在大肠杆菌中表达缓冲液平衡His-Bind亲和萃取小柱，使上清液以量，对重组菌的培养条件进行了优化，包括诱导剂 10mLh~速度流过亲和萃取柱.先用10倍体积结 IPTG使用浓度，温度，诱导培养时间等对hERP- 合缓冲液冲洗萃取柱，然后用6倍体积洗涤液(0.5 LBD蛋白表达的影响结果如图2所示，图2为 mol .LI NaCl,20 mmol .LITris-HCI.60 mmol. hERB LBD蛋白及其临近蛋白条带的密度图谱，箭 L吲唑，pH7.9)冲洗，用6倍体积洗脱液(0.5 头所指为hERB LBD蛋白密度图谱.其中图2(a) mol -L NaCl,20mmol-L1 Tris-HCl.1mol-L 为IPTG诱导剂浓度的影响，1：0.1 mmol .L;2: 吲唑，pH7.9)洗脱，收集洗脱液，用Tris一HCl(20 0.2mmol L1:3:0.4mmol-L-1:4:0.6 mmol .L-1. mmol+L1,pH7.5)透析后，加入蛋白酶抑制剂，图2(b)为培养温度的影响，1：15℃；2：20℃；3：25 一80℃保存，用12%SDS-PAGE鉴定蛋白纯度， ℃；4.30℃.图2(c)为诱导后培养时间的影响，1：8 用Bradford法测定蛋白浓度. h;2.12h;3:20h;4:24h. 1.6融合蛋白活性测定结果表明，重组菌在IPTG浓度≥0.2mmol· 用Tris-HCl(20 mmol +L,pH7.5)分别将雌 L时蛋白表达量达到最大（图2(a);温度对目标二醇标记牛血清白蛋白(E2BSA)与hERB LBD蛋蛋白表达的影响随温度的升高呈先增加后降低的趋白配成浓度为100gmL溶液.两种溶液等体积势，当培养温度为25℃时，可溶蛋白中目标蛋白质混合，4℃过夜.过夜后混合液离心(12000r· 的表达量最高（图2(b);诱导培养8h后，对于重组

冷却．分别用12％ SDS－PAGE 分离诱导及未诱导样品检测表达效果． 1∙4 融合蛋白表达条件的优化（1）诱导剂浓度的优化．接菌到100mL 培养基OD 为0∙5～0∙7时加入 IPTG使其浓度分别为 0∙10∙20∙40∙6mmol·L －1培养3h（37℃200r· min －1）室温离心（10000r·min －110min）弃上清液．把每种沉淀重悬于结合缓冲液中（0∙5mol·L －1 NaCl20mmol·L －1 Tris－HCl5mmol·L －1吲唑 pH7∙9每100mL 培养基10mL 缓冲液）用超声波破碎仪破碎细胞（功率450W工作时间3s间隔时间3s总时间6min）．将破碎液离心后（12000r· min －120min）分离沉淀及上清用12％ SDS－ PAGE 分离可溶蛋白用软件“电泳图谱制作器 V1∙0”绘制电泳图谱检测表达效果．（2）诱导温度的优化．接菌到100mL 培养基 OD 为 0∙5～0∙7 时加入 IPTG工作浓度为 0∙2 mmol·L －1200r·min －1振荡培养3h诱导温度分别为15202530℃室温离心（10000r·min －110 min）弃上清液．用上述方法破碎细胞检验表达效果．（3）诱导时间的优化．接菌到100mL 培养基 OD 为 0∙5～0∙7 时加入 IPTG工作浓度为 0∙2 mmol·L －1温度25℃振荡培养时间为：81220 24h室温离心（10000r·min －110min）弃上清液．用上述方法破碎细胞检验表达效果． 1∙5 融合蛋白的纯化按1∙4节的方法收集细菌加入蛋白酶抑制剂经超声破碎后离心取上清．依次用3倍体积去离子水5倍体积 NiSO4（0∙05mol·L －1）3倍体积结合缓冲液平衡 His-Bind 亲和萃取小柱．使上清液以 10mL·h －1速度流过亲和萃取柱．先用10倍体积结合缓冲液冲洗萃取柱然后用6倍体积洗涤液（0∙5 mol·L －1 NaCl20mmol·L －1Tris－HCl60mmol· L －1吲唑pH7∙9）冲洗．用6倍体积洗脱液（0∙5 mol·L －1 NaCl20mmol·L －1 Tris－HCl1mol·L －1 吲唑pH 7∙9）洗脱收集洗脱液用 Tris－HCl（20 mmol·L －1pH 7∙5）透析后加入蛋白酶抑制剂－80℃保存．用12％ SDS－PAGE 鉴定蛋白纯度用 Bradford 法测定蛋白浓度． 1∙6 融合蛋白活性测定用 Tris－HCl （20mmol·L －1pH7∙5）分别将雌二醇标记牛血清白蛋白（E2－BSA）与 hERβ－LBD 蛋白配成浓度为100μg·mL －1溶液．两种溶液等体积混合4℃ 过夜．过夜后混合液离心（12000r· min －110min）取上清液用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离．加样量为20μL·孔－1以 E2－ BSAhERβ－LBD 蛋白作为对照．银染法检测蛋白质． 2 结果与讨论将人工构造 hERβ－LBD 质粒转移到大肠杆菌感受态细胞中在 LB 平板上涂板并过夜培养后有白色菌落出现证明 hERβ－LBD 表达质粒已转化到宿主细胞中．对经 IPTG 诱导和未经诱导的重组菌可溶性蛋白进行电泳分析（图1其中1为未经诱导的 hERβ－LBD 重组菌；2为经诱导的 hERβ－LBD 重组菌）表明经 IPTG 诱导后重组细菌中有较强的蛋白表达其分子量约30kD与根据氨基酸序列计算出的 hERβ配体结合区蛋白分子量相近［6］而未经诱导的细菌中没有该蛋白条带证明重组大肠杆菌细胞中有 hERβ－LBD 蛋白合成．图1 hERβ－LBD 和 hERβ－LBD 基因重组大肠杆菌可溶性蛋白电泳图为了提高 hERβ－LBD 蛋白在大肠杆菌中表达量对重组菌的培养条件进行了优化包括诱导剂 IPTG 使用浓度温度诱导培养时间等对 hERβ－ LBD 蛋白表达的影响结果如图2所示．图2为 hERβ－LBD 蛋白及其临近蛋白条带的密度图谱箭头所指为 hERβ－LBD 蛋白密度图谱．其中图2（a）为 IPTG 诱导剂浓度的影响1：0∙1mmol·L －1 ；2： 0∙2mmol·L －1 ；3：0∙4mmol·L －1 ；4：0∙6mmol·L －1．图2（b）为培养温度的影响1：15℃；2：20℃；3：25 ℃；4：30℃．图2（c）为诱导后培养时间的影响1：8 h；2：12h；3：20h；4：24h．结果表明重组菌在 IPTG 浓度≥0∙2mmol· L －1时蛋白表达量达到最大（图2（a））；温度对目标蛋白表达的影响随温度的升高呈先增加后降低的趋势当培养温度为25℃时可溶蛋白中目标蛋白质的表达量最高（图2（b））；诱导培养8h 后对于重组 Vol．29Suppl．2 时国庆等：雌激素受体 ERβ配体结合区的异源表达与纯化 ·209·

,210 北京科技大学学报 2007年增刊2 其与雌激素受体结合后放射性活度的变化来评价雌 (a) b () 激素受体的配体结合活性[)].这种方法虽然准确度高，但是由于试剂昂贵，且需要进行放射性操作，所以一般实验室难以进行，本研究中，建立了一种简单 EEE 方便的对雌激素受体的配体结合活性进行评价的方法，即利用雌激素受体、或其配体结合片段与共价连接在牛血清白蛋白(BSA)上的雌二醇结合后，新生成的复合物分子量发生很大变化的特点，利用非变性电泳进行分离，利用银染法进行蛋白检测的技术，研究了hERB LBD蛋白与E2BSA的结合活性（图 4).图4中1,2,3依次为Es-BSA(100ngL)、 ERP(100ngL-1)、两者的过夜混合物，加样量均为20L·结果显示，二者充分反应后，hERB LBD 蛋白与E2BSA的电泳条带均显著减弱，其中hERB LBD蛋白的条带几乎完全消失，而hERB LBD电图2不同培养条件对hERB-LBD蛋白表达的影响泳带中上部的两条杂蛋白条带没有明显变化，这说明，hER B LBD蛋白与E2BSA的E2-基团发生了菌可溶蛋白中目标蛋白质的表达量即达到最高值，特异性结合反应，即通过异源表达方法制备的hER 对于增加培养时间目标蛋白质的表达量无明显变化一HBD蛋白具有雌激素配体结合活性，同时，这也 (图2(c)·因此，本研究优化重组大肠杆菌培养条证明了建立的对雌激素受体的配体结合活性进行评件为：诱导剂PTG使用浓度0.2 mmol .L-1,培养价的电泳方法是可行的温度25℃，诱导培养时间8h.在优化条件下，经亲色谱纯化后，最高目标蛋白表达量达到236mg· L-1 由于本研究中所表达的重组蛋白含一段“组氨酸”标签(His一ag),因此可以用Ni亲和层析柱将重组蛋白选择性萃取.利用亲和层析法纯化了细胞破壁后上清液中的hERP-LBD蛋白，并用SDS一 PAGE对蛋白纯度进行了鉴定，结果如图3所示，其中1为hERB-LBD蛋白；2为marker,纯化后 hERB-LBD蛋白的相对分子量为30kD,对电泳图扫描分析后显示，蛋白纯度大于90%. 图4非变性电泳检测hERB-LBD蛋白的配体结合活性 97.4kD 66.2 3结论 43.0 本文成功构建了可分泌hERB LBD蛋白的重 31.0 组大肠杆菌，优化了表达条件，在诱导剂(IPTG)浓度为0.2 nmolL-1,诱导温度25℃，诱导时间为8h 20.1 的条件下，hERB-LBD蛋白表达量最多.利用亲和色谱法纯化了hERB-LBD蛋白，蛋白纯度达90% 图3纯化后hERB-LBD蛋白的SDS-PAGE分析以上，并初步建立了评价雌激素受体配体结合活性是否具有雌激素配体结合活性是评价异源表达的电泳方法，利用该方法证明本研究所获得的雌激素雌激素受体蛋白成功与否的关键指标，目前，绝大受体蛋白配体结合片段具有雌激素结合活性，可以用多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为配体，通过于研究环境化合物与雌激素受体的相互作用研究

图2 不同培养条件对 hERβ－LBD 蛋白表达的影响菌可溶蛋白中目标蛋白质的表达量即达到最高值对于增加培养时间目标蛋白质的表达量无明显变化（图2（c））．因此本研究优化重组大肠杆菌培养条件为：诱导剂 IPTG 使用浓度0∙2mmol·L －1培养温度25℃诱导培养时间8h．在优化条件下经亲和色谱纯化后最高目标蛋白表达量达到236mg· L －1．由于本研究中所表达的重组蛋白含一段“组氨酸”标签（His－tag）因此可以用 Ni 亲和层析柱将重组蛋白选择性萃取．利用亲和层析法纯化了细胞破壁后上清液中的 hERβ－LBD 蛋白并用 SDS－ PAGE 对蛋白纯度进行了鉴定结果如图3所示其中1 为 hERβ－LBD 蛋白；2 为 marker．纯化后 hERβ－LBD 蛋白的相对分子量为30kD对电泳图扫描分析后显示蛋白纯度大于90％．图3 纯化后 hERβ－LBD 蛋白的 SDS－PAGE 分析是否具有雌激素配体结合活性是评价异源表达雌激素受体蛋白成功与否的关键指标．目前绝大多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为配体通过其与雌激素受体结合后放射性活度的变化来评价雌激素受体的配体结合活性［7］．这种方法虽然准确度高但是由于试剂昂贵且需要进行放射性操作所以一般实验室难以进行．本研究中建立了一种简单方便的对雌激素受体的配体结合活性进行评价的方法即利用雌激素受体、或其配体结合片段与共价连接在牛血清白蛋白（BSA）上的雌二醇结合后新生成的复合物分子量发生很大变化的特点利用非变性电泳进行分离利用银染法进行蛋白检测的技术研究了 hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的结合活性（图 4）．图4中123依次为 Es－BSA（100ng·μL －1）、 ERβ（100ng·μL －1）、两者的过夜混合物加样量均为20μL．结果显示二者充分反应后hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的电泳条带均显著减弱其中 hERβ －LBD 蛋白的条带几乎完全消失而 hERβ－LBD 电泳带中上部的两条杂蛋白条带没有明显变化．这说明hERβ－LBD 蛋白与 E2－BSA 的 E2－基团发生了特异性结合反应即通过异源表达方法制备的 hER －LBD 蛋白具有雌激素配体结合活性．同时这也证明了建立的对雌激素受体的配体结合活性进行评价的电泳方法是可行的．图4 非变性电泳检测 hERβ－LBD 蛋白的配体结合活性 3 结论本文成功构建了可分泌 hERβ－LBD 蛋白的重组大肠杆菌．优化了表达条件在诱导剂（IPTG）浓度为0∙2mmol·L －1诱导温度25℃诱导时间为8h 的条件下hERβ－LBD 蛋白表达量最多．利用亲和色谱法纯化了 hERβ－LBD 蛋白蛋白纯度达90％以上．并初步建立了评价雌激素受体配体结合活性的电泳方法利用该方法证明本研究所获得的雌激素受体蛋白配体结合片段具有雌激素结合活性可以用于研究环境化合物与雌激素受体的相互作用研究． ·210· 北京科技大学学报 2007年增刊2

参考文献［1］时国庆江桂斌．环境化学进展．北京：化学工业出版社 2005：346 ［2］ Hall J MCouse J FKorach K S．The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling．J Biol Chem2001 276（40）：36869 ［3］ Shiau A KBarstad DRadek J Tet al．Structural characterization of a subtype-selective ligand reveals a novel mode of estrogen receptor antagonism．Nat Struct Biol20029（5）：359 ［4］ Kuiper G GCarlsson BGrandien Ket al．Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta．Endocrinology1997138（3）：863 ［5］ Kuiper G GEnmark EPelto-Huikko Met al．Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary．Proc Natl Acad Sci USA199693（12）：5925 ［6］ Pike A C WBrzozowski A MHubbard R Eet al．Structure of the ligand-binding domain of oestrogen receptor beta in the presence of partial agonist and a full antagonist．EMBO J199918 （17）：4608 ［7］ Feng WGraumann KHahn Ret al．Affinity chromatography of human estrogen receptor-alpha expressed in Saccharomyces cerevisiae．Combination of heparin-and 17beta-estradio-l affinity chromatography．J Chromatogr A1999852（1）：161 Heterologous expression and purification of the ligand binding domain of estrogen receptor β SHI GuoqingGUO Y anfengWEI WeiSONG QingZHA NG HuaiZHONG Guangrong Applied Science SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China ABSTRACT In order to investigate the interaction between environmental chemicals and estrogen receptors the ligand binding domain of human estrogen receptor β（hERβ－LBD） was expressed in Escherichia coli．Based on the optimized expression conditions （IPTG0∙2mmol·L －1 ；culture temperature25℃；time of induction 8h）after purified by affinity chromatographythe production of hERβ－LBD can be reached to236mg·L －1． KEY WORDS estrogen receptor；ligand binding domain；expression；purification Vol．29Suppl．2 时国庆等：雌激素受体 ERβ配体结合区的异源表达与纯化 ·211·

点击进入文档下载页（PDF格式）

已到末页，全文结束

点击下载（PDF格式）

浏览记录