蛋白质 半乳甘露聚糖3.7 半乳糖胺 表6.3.2镁离子和铵离子对柠棣酸发酵的影响 因素 镁缺乏 镁充分 PFK (任意单位)1 0 柠檬酸的合成发生在TCA循环中,由柠檬酸合成酶催化。对柠檬酸能在A. nigar中积 累的机理曾提出过一些不同的看法。有人认为是A. nigar中缺少乌头酸水合酶和异柠檬酸 脱氢酶,但以后有人从A. nigar中分离得到了这两种酶,而且进一步确定了乌头酸水合酶 存在于线粒体中,它催化的反应存在着柠檬酸:异柠檬酸:顺式乌头酸=90:7:3的平衡 关系:同时还发现在A. nigar中对辅酶NAD专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低,却有三种 依赖于辅酶NADP的异柠檬酸脱氢酶,其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关,它 们受到生理浓度柠檬酸的抑制。这一现象可以解释为什么在A. nigar中异柠檬酸不会进 步分解及柠檬酸的积累机制。在A. nigar中还发现了高浓度葡萄糖和铵离子对α-酮戊二酸 脱氢酶的阻遏作用,该酶催化TCA循环中唯一的不可逆反应。TCA循环中的二羧酸部分只有 琥珀酸脱氢酶受到低浓度草酰乙酸的强烈抑制,从而防止了柠檬酸分解为草酰乙酸的反应, 促进了柠檬酸积累。其它酶似乎不受代谢调节,只是受到底物和产物的控制。 总之,在A. nigar发酵生产柠檬酸的过程中,应该保持高底物浓度、高铵离子浓度、 高通氧强度及低镁离子浓度、低磷酸盐浓度,发酵的温度应在28-35℃的范围内,pH调节到 2.2-2.6之间。在上述条件下,从葡萄糖生产柠檬酸的转化率可以达到理论转化率的90%以 上。在柠檬酸发酵中,国外一般采用糖蜜或淀粉水解的葡萄糖作为原料。我国的微生物工作 者根据中国的国情及A. nigar能够产生淀粉酶的特点,成功地选育了能够直接利用淀粉质 粗原料(如薯干粉及玉米粉等)发酵生产柠檬酸的高产菌种,并用于大规模工业化生产,降低 了生产成本,取得了良好的效果 6.3.2利用烷烃生产柠檬酸的假丝酵母 1963年, Yamada等人发现棒状杆菌( corynebacteria)能够利用正烷烃为碳源生产谷氨 酸,几乎同时,日本的发酵工业界也开始了从正烷烃为碳源生产柠檬酸的研究和开发,并发 现假丝酵母是符合要求的微生物。在假丝酵母中,正烷烃首先被氧化为脂肪酸,随后脂肪酸 进一步经β-氧化生成乙酰辅酶A进入TCA循环,为了补充草酰乙酸,还存在一个额外的乙醛 酸循环。 假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程的代谢调节机理至今仍不清楚,但发酵过程具有以 下一些特点:1)发酵分为两个阶段,第一阶段只生长酵母,只有当培养基中的氮源消耗完 以后才开始积累柠檬酸:2)发酵液的p值应保持在p5以上;3)高铁离子浓度会增加乌 头酸水合酶的活性,引起柠檬酸产量减少:4)产物中异柠檬酸的比例很高,甚至达到50% 通过各种诱变育种及添加乌头酸水合酶抑制剂(如氮氟乙酸、2,4-二硝基苯酚及某些醇类) 可以降低异柠檬酸的比例,但仍高于黑曲霉葡萄糖发酵生产柠檬酸的过程 七十年代初,假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程首先在日本实现了工业化生产,并 将该技术输出到美国和欧洲。但是由于七十年代中期出现了石油危机及过程本身存在的缺 点,该过程很快就停止了工业化生产。10 蛋白质 2．4 3．9 半乳甘露聚糖 半乳糖胺 3．7 12．8 脂类物质 0．5 0．5 表 6.3.2 镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响 因素 镁缺乏 镁充分 NH4 + 15mM 3mM 柠檬酸 4mM 1mM PFK 酶活（任意单位） 1.1 1.0 柠檬酸的合成发生在 TCA 循环中，由柠檬酸合成酶催化。对柠檬酸能在 A. nigar 中积 累的机理曾提出过一些不同的看法。有人认为是 A. nigar 中缺少乌头酸水合酶和异柠檬酸 脱氢酶，但以后有人从 A. nigar 中分离得到了这两种酶，而且进一步确定了乌头酸水合酶 存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3 的平衡 关系；同时还发现在 A. nigar 中对辅酶 NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种 依赖于辅酶 NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及 TCA 循环有关，它 们受到生理浓度柠檬酸的抑制。这一现象可以解释为什么在 A. nigar 中异柠檬酸不会进一 步分解及柠檬酸的积累机制。在 A. nigar 中还发现了高浓度葡萄糖和铵离子对-酮戊二酸 脱氢酶的阻遏作用，该酶催化 TCA 循环中唯一的不可逆反应。TCA 循环中的二羧酸部分只有 琥珀酸脱氢酶受到低浓度草酰乙酸的强烈抑制，从而防止了柠檬酸分解为草酰乙酸的反应， 促进了柠檬酸积累。其它酶似乎不受代谢调节，只是受到底物和产物的控制。 总之，在 A. nigar 发酵生产柠檬酸的过程中，应该保持高底物浓度、高铵离子浓度、 高通氧强度及低镁离子浓度、低磷酸盐浓度，发酵的温度应在 28-350 C 的范围内，pH 调节到 2.2-2.6 之间。在上述条件下，从葡萄糖生产柠檬酸的转化率可以达到理论转化率的 90%以 上。在柠檬酸发酵中，国外一般采用糖蜜或淀粉水解的葡萄糖作为原料。我国的微生物工作 者根据中国的国情及 A. nigar 能够产生淀粉酶的特点，成功地选育了能够直接利用淀粉质 粗原料(如薯干粉及玉米粉等)发酵生产柠檬酸的高产菌种，并用于大规模工业化生产，降低 了生产成本, 取得了良好的效果。 6.3.2 利用烷烃生产柠檬酸的假丝酵母 1963 年，Yamada 等人发现棒状杆菌(Corynebacteria)能够利用正烷烃为碳源生产谷氨 酸，几乎同时，日本的发酵工业界也开始了从正烷烃为碳源生产柠檬酸的研究和开发，并发 现假丝酵母是符合要求的微生物。在假丝酵母中，正烷烃首先被氧化为脂肪酸，随后脂肪酸 进一步经-氧化生成乙酰辅酶 A 进入 TCA 循环，为了补充草酰乙酸，还存在一个额外的乙醛 酸循环。 假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程的代谢调节机理至今仍不清楚，但发酵过程具有以 下一些特点：1）发酵分为两个阶段，第一阶段只生长酵母，只有当培养基中的氮源消耗完 以后才开始积累柠檬酸；2）发酵液的 pH 值应保持在 pH5 以上；3）高铁离子浓度会增加乌 头酸水合酶的活性，引起柠檬酸产量减少；4）产物中异柠檬酸的比例很高，甚至达到 50%， 通过各种诱变育种及添加乌头酸水合酶抑制剂（如氮氟乙酸、2，4-二硝基苯酚及某些醇类） 可以降低异柠檬酸的比例，但仍高于黑曲霉葡萄糖发酵生产柠檬酸的过程。 七十年代初，假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程首先在日本实现了工业化生产，并 将该技术输出到美国和欧洲。但是由于七十年代中期出现了石油危机及过程本身存在的缺 点，该过程很快就停止了工业化生产