。224 北京科技大学学报 2007年增刊2 有较大影响.在本研究中，如图1所示，在底物浓度 (1)酶反应在一定的温度范围内，其速度随温度升高 较低时，反应速度随底物浓度增加而升高.在底物 而加快：(2)化学本质为蛋白质的酶，遇热易变性失 浓度为130mmol/L的条件下，Rhodococcus 去活性.温度对反应速度的影响是以上两种相反作 rhodochrous tg一A6腈水解酶的活力达到最高：而高 用综合的结果.在低于最适温度时，由于温度升高， 浓度的底物则抑制酶活，当底物浓度达到168 反应物的碰撞机率大大增强，反应速度增加：但高于 mmol/L以上，酶的活力仅为最高酶活时的70%. 最适温度时，酶蛋白的变性逐渐突出，反应速率随温 根据底物和酶的中间复合物学说7，在酶浓度恒定 度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应所抵消，则 条件下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时 反应速率迅速下降. 反应速率取决于底物浓度.当溶液中的酶全部被底 2.3酶的热稳定性 物饱和，反应达到最大反应速率.Mathew等用产 取菌体分别置于不同温度下保温，每隔1h测 睛水解酶的菌株R.rhodochrousJ1催化3氰基吡 定酶活，图3给出了该菌株腈水解酶的温度耐受性 啶转化烟酸时，也发现腈水解酶会受到高浓度底物 可以看出随着时间增加，温度越高，酶活的下降趋势 的强烈抑制作用，最终转化率很低.为获得高浓度 越快.本实验中，55℃时酶失活非常快，4h后，酶活 产物的酶催化反应，可以通过控制底物的浓度来克 只剩下3016%，而45℃时酶活的下降速率明显降 服底物的抑制作用，如周期性或连续性地向反应体 低，25℃时酶活则基本上保持稳定. 系中流加底物，使酶催化反应保持在恒定的低底物 因此，尽管55℃下测定酶活较高，但在实际催 浓度下进行8劉， 化过程中，为了长时间保持酶的催化效率，应在较低 120 温度下进行催化. 120 90 90F 60 60 30 ★25℃ ◆35℃ 30 ■45℃ 0 ●-55℃ 306090120150 3-氰基吡啶的浓度(mmol.L) 时间h 图】底物浓度对酶活的影响 图3腈水解酶的温度耐受性 因此，在实际催化过程中，底物3氰基吡啶的 最佳浓度为130mmo/L. 2.4pH值对初始酶活的影响 2.2温度对酶活的影响 pH值是影响酶催化性能的重要因素，A上 取菌体在不同温度下测定酶活，结果见图2.可 mataw ah等4发现，产耐热性腈水解酶的Bacillus 以看出，酶活随温度升高而逐渐增加，最佳催化温度 pallidus Dac521细胞在pH8.0时催化3氰基吡啶 为55℃当催化温度超过60℃随着温度的升高酶 的活力最佳：M athew等列用R.rhodochrous J1催 活迅速下降，在65℃酶活仅为最高时的19%.这主 化3-氰基吡啶发现其最适pH在8~9范围内.在 要因为温度对于酶的作用有两种不同的影响？： 本研究中，菌体分别重悬于不同pH的缓冲液中，初 120 始酶活测定结果如图4所示.可看出在pH4.5~ 90 7.0范围内酶活随pH升高而逐渐增加，在pH7.0 达到最高活性.该菌株的腈水解酶在pH6.0~9.0 60 范围内表现出较高且稳定的活性，相比其它腈水解 酶具有较宽的pH催化范围. 2.5酶对pH值的稳定性 菌体分别用不同pH的缓冲液重悬并置于25℃ 30 50 70 温度/℃ 水浴保温3h,测定其酶活，pH值的耐受性如图5所 示.在H4.5~9.0时酶活基本上都保持稳定，但 图2温度对酶活的影响 在偏酸性的条件下，随着pH值的下降酶活逐渐下有较大影响 .在本研究中, 如图 1 所示, 在底物浓度 较低时, 反应速度随底物浓度增加而升高.在底物 浓 度 为 130 mmol/L 的 条 件 下, Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 腈水解酶的活力达到最高;而高 浓度的底物则抑 制酶活, 当底物浓 度达到 168 mmol/L 以上, 酶的活力仅为最高酶活时的 70 %. 根据底物和酶的中间复合物学说[ 7] , 在酶浓度恒定 条件下, 当底物浓度很小时, 酶未被底物饱和, 这时 反应速率取决于底物浓度 .当溶液中的酶全部被底 物饱和, 反应达到最大反应速率.Mathew 等[ 3] 用产 腈水解酶的菌株 R .rhodochrous J1 催化 3-氰基吡 啶转化烟酸时, 也发现腈水解酶会受到高浓度底物 的强烈抑制作用, 最终转化率很低 .为获得高浓度 产物的酶催化反应, 可以通过控制底物的浓度来克 服底物的抑制作用, 如周期性或连续性地向反应体 系中流加底物, 使酶催化反应保持在恒定的低底物 浓度下进行[ 8] . 图 1 底物浓度对酶活的影响 因此, 在实际催化过程中, 底物 3-氰基吡啶的 最佳浓度为 130 mmol/L . 图 2 温度对酶活的影响 2.2 温度对酶活的影响 取菌体在不同温度下测定酶活, 结果见图2 .可 以看出, 酶活随温度升高而逐渐增加, 最佳催化温度 为55 ℃, 当催化温度超过 60 ℃, 随着温度的升高酶 活迅速下降, 在 65 ℃酶活仅为最高时的 19 %.这主 要因为温度对于酶的作用有两种不同的影响[ 7] : ( 1) 酶反应在一定的温度范围内, 其速度随温度升高 而加快;( 2) 化学本质为蛋白质的酶, 遇热易变性失 去活性 .温度对反应速度的影响是以上两种相反作 用综合的结果 .在低于最适温度时, 由于温度升高, 反应物的碰撞机率大大增强, 反应速度增加;但高于 最适温度时, 酶蛋白的变性逐渐突出, 反应速率随温 度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应所抵消, 则 反应速率迅速下降 . 2.3 酶的热稳定性 取菌体分别置于不同温度下保温, 每隔 1 h 测 定酶活, 图 3 给出了该菌株腈水解酶的温度耐受性, 可以看出随着时间增加, 温度越高, 酶活的下降趋势 越快.本实验中, 55 ℃时酶失活非常快, 4 h 后, 酶活 只剩下 30.16 %, 而 45 ℃时酶活的下降速率明显降 低, 25 ℃时酶活则基本上保持稳定 . 因此, 尽管 55 ℃下测定酶活较高, 但在实际催 化过程中, 为了长时间保持酶的催化效率, 应在较低 温度下进行催化. 图3 腈水解酶的温度耐受性 2.4 pH 值对初始酶活的影响 pH 值是 影响酶 催化性 能的重 要因素, Al￾mataw ah 等[ 4] 发现, 产耐热性腈水解酶的 Bacillus pallidus Dac521 细胞在 pH 8.0 时催化 3-氰基吡啶 的活力最佳 ;M athew 等 [ 3] 用 R .rhodochrous J1 催 化 3-氰基吡啶发现其最适 pH 在 8 ～ 9 范围内 .在 本研究中, 菌体分别重悬于不同 pH 的缓冲液中, 初 始酶活测定结果如图 4 所示 .可看出在 pH 4.5 ～ 7.0 范围内酶活随 pH 升高而逐渐增加, 在 pH 7.0 达到最高活性.该菌株的腈水解酶在 pH 6.0 ～ 9.0 范围内表现出较高且稳定的活性, 相比其它腈水解 酶具有较宽的 pH 催化范围. 2.5 酶对 pH 值的稳定性 菌体分别用不同pH 的缓冲液重悬并置于 25 ℃ 水浴保温 3 h, 测定其酶活, pH 值的耐受性如图 5 所 示 .在 pH 4.5 ～ 9.0 时酶活基本上都保持稳定, 但 在偏酸性的条件下, 随着 pH 值的下降酶活逐渐下 · 224 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2